Способ выделения и очистки внеклеточной гуанилрибонуклеазы тriсноdеrма наrziаnuм
Изобретение относится к микробиологической промьшшенности, в частности к способу выделения гуанилрибонуклеазы, применяется в молекулярной биологии для изучения структуры РНК и ферментативном синтезе олигоркбонуклеотидов Сущность изобретения заключается в том, что фильтрат культуральной жидкости Tricho- derma harzianum хроматографируют непосредственно на КМ-целлю,гюзе при рН 5 ,0-7,3, при этом сорбцию осуществляют в статике или динамике, а элюцию в динамике ступенчатым градиентом 0,2 и 0,5 М ацетата натрия рН 7,3 или 0,25 М трис-НС с 1,0 М NaCl, или прямолинейным градиентом 0,01- 0,5 М ацетатно-аммиачного буфера рН 5,3, после чего активные фракции подвергают диализу против О,01-0,02М трис-НС1 буфера рН 7,3-7,7, пропускают через ДЭАЭ-целлюлозу в тпм же буфере и окончательно хроматографируют на КМ-целлюлозе, при этом для элюции используют ацетатно-ам миачный буфер рН 5,4 или прямолинейный градиент 0,01-0,5 М хлористого натрия в 0,02 М трис-НС1 буфере, или последовательно два градиента: вначале прямолинейный градиент 0,01-0,05 М трис- НС буфера рН 7,3, а затем градиент 0,2 М хлористого натрия в трис-НС1 буфере того же рН. Предложенньй способ позволяет получить гуанилрибонуклеазу со щелочными свойствами с выходом 48-54% и удельной активностью 2860-4500 ед/мл, которая в отличие от РНКазы С,; легко отделяется от кислых продуктов ее действия сорбцией на катионитах и легче иммобилизуется трад}П1Ионными способами. 1 табл. С ГС С© оо
СОЮЗ СОНЕТСНИХ
ССЦМЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСг1УБЛИН
„„БО„„1392093
ОПРОАНКЕ ИЗОБРЕТЕ ;ИЛ
H А БЧ ОРЛИНОМУ СЗИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОЫИТЕТ СССР
ПО ДЕЛМЯ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4072305/31 — "i 3 (22) 11.04.86 (46) 30.04.88. Бюл. № 16 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов и Институт биохимии им. A.H.Áàõà (72) С.И.Безбородова, Е.С.ВасильеваТонкова и A.Ì.Áåçáîðîäîâ (53) 663.15(088.8) (56) Безбородова С.И., Бородаева Л.И., Панкова Л.H. Способность низших грибов синтезировать внеклеточные РНКазы". — Микробиология, 1968, т. 31, вып. 1, с в 10-14.
Авторское свидетельство СССР № 1125982, кл. С 12 N 9/04, 1984, (54) СПОСОБ ВСЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ГУЛНИЛРИБОНУКЛЕАЗБ! TKTCHODERMA HARZIANUM (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности. в частности к способу выделения гуанилрибонуклеазы, применяется в молекулярной биологии для изучения структуры РНК и ферментативном синтезе олигорибонуклеотидов. Сущность изобретения заключается в том, что фильтрат культуральной жидкости Trichoderma harzianum хроматографируют непосредственно на КМ-целлюлозе при рН (51) 4 С 12 N 9/22//(С 12 N 9/22, С 1? R 1:885
5,0-7,3, при этом сорбцию осуществляют в статике или динамике, а элюцию в динамике ступенчатым грациентом
0,2 и 0,5 М ацетата натрия рН 7,3 или 0,25 М тряс-НС1 с 1,0 M NaC1, или прямолинейным градиентом 0,010,5 М ацетатно-аммиачного буфера рН 5,3, после чего активные фракции подвергают диализу против 0,01-0,02 М тряс-НС1 рН 7,7, пропус— кают через ДЭАЗ-целлюлозу в том же буфере и окончательно хроматографируют на КМ-целлюлозе, при этом для элюции используют ацетатно-аммиачный буфер рН 5,4 или прямолинейный градиент 0 01-0,5 М хлористого натрия:в
0,02 М трис-НС1 буфере, или последовательно два градиента: вначале прямолинейный градиент 0,01-0,05 M трисНС1 буфера рН 7,3, а затем градиент
0,2 М хлористого натрия в трис-НС1 буфере того же рН. Предложенный способ позволяет получить гуанилрибонуклеазу со щелочными свойствами с выходом 48-547 и удельной активностью
2860-4500 ед/мл, которая в отличие от РНКазы С легко отделяется от кислых продуктов ее действия сорбцией на катионитах и легче иммобилизуется традиционными способами, 1 табл.
1 1 92093
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу выделения гуанилрибо( нуклеазы (рибонуклеат-3 -гуанилооли-. гонуклеотид-гидролазы, К.Ф.З.1.27.3), 5 применяемой в молекулярной биологии при изучении структуры РНК для получения нуклеозид-2,.3 -циклофосфатов, а также при ферментативном синтезе олигорибонуклеотидов с. заданной последовательностью нуклеотидов.
Изобретение заключается в том, что фильтрат культуральной жидкости, полученной в результате выращивания
Trichoderma harzianum 0l на комплексной питательной среде., хроматографируют непосредственно на КМ-целлюлозе, при этом сорбцию осуществляют в статике или динамике, a:элюцию — в дина- 20 мике градиентом ацетата натрия или ацетата аммония, или хлористого натрия в буфере, после чего активные фракции подвергают диализу против буфера, пропускают через ДЭАЗ-целлюло- 25 зу и хроматографируют на KN-целлюлозе.
Предлагаемый способ заключа.ется в следующем.
Культуральную жидкость, полученную после выращивания на комплексной питательной среде гриба Trichoderma
harzianum О 1, филь.i"ðóíт через бумагу на вакуум †фильт. При сорбции в динамике пропускают через колонку с KNцеллюлозой со скоростью 100 †5 мл/ч.
При сорбции в статике в фильтрат культуральной жидкости вносят 1/10 влажного веса KN-целлклозы (вес на объем), перемешивают, фильтруют и сорбент переносят в колонку. Основная масса сопутствующих белков и пигментов не сорбируется на KN-целлюлозе. За счет этого достигается очистка в 100-500 раа. После промывки
45 колонки фермент элюируют ацетатом натрия или ацетатом аммония, или солью в буфере. Выход по активности достигает 70%. Активные фракции диализуют против трис-НС1 буфера и пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлю50 лозой. Рибонуклеаза проходит через колонку, не сорбируясь, а часть сопутствующих белкоь и пигментов связывается сорбентом. При этом достигается 8 — 15-кратная очистка с
100%-ным выходом по активности. Далее рибонуклеазу хроматографируют на
КМ-целлюлозе в том же буфере ° Для элюции используют ступенчатый или прямолинейный градиент хлористого натрия в буфере или последовательно два градиента.
В результате получают гуанилрибонуклеазу с изоэлектрической точкой около 9,5, активностью 2500 4500 ед/
/А во=l, в известных единицах, выходом 48-57%, степенью очистки в пределах от 6000 до 8000 раз.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами °
Пример 1. 11,0 л культуральной жидкости Tr. her zianum О 1 фильтруют через бумажный фильтр на вакуум-фильтре и фильтрат с активностью
14,5 ед/мл подкисляют до рН 5, 15,3 2 М соляной кислотой и вносят в колонку с КМ-целлюлозой, предварительно уравновешенной 0,01 M ацетатно-аммиачным буфером рН 5„4, со скоростью 500 мл/ч. Затем колонку промывают 0,01 М ацетатно-аммиачным буфером рН 5,3 и элюируют фермент прямолинейным градиентом буфера (0,010,5 М) того же рН со скоростью
160 мл/ч. Активные фракции концентрируют ультрафильтрацией через мембрану УМ-2 и диализуют против 0,01 М трис-НС1 буфера рН 7,7. Затем раствор фермента вносят в колонку с ДЭАЗцеллюлозой (4хlб см), уравновешенную тем же буфером, со скоростью 100 мп/ч и промывают 100 мл исходного буфера.
Вся активность фермента находится во фракциях, выходящих из колонки.
После подкисления до рН 5,0 0,5 М уксусной кислотой раствор фермента, вносят со скоросгью 60 мл/ч в колонку с KM-целлюлозой (2х7 см), уравновешенной 0,01 М ацетатно-аммиачным буфером, рН 5,4. Фермент элюируют
0,5 М ацетатно-аммиачным буфером того же рН. Получают 7 мл раствора фермента с удельной активностью
2860 ед/А 0=1 и степенью очистки в
6000 раз с выходом по активности 50%.
Пример 2. 27 л фильтрата культуральной жидкости с активностью
15 ед/мл, полученного в результате выращивания гриба Tr. harzianum О 1, после подкисления до рН 5,5-6,0 2 М соляной кислотой вносят в 4 парал- лельные колонки с КМ-целлюлозой (3 KQJIQHI 1392093 ходным буфером и элюируют фермент последовательно ступенчатым градиентом 0,2 и 0,5 M ацетата натрия рН 7,4. Активные фракции концентрируют ультрафильтрацией через мембрану УМ-2, 5 концентрат диализуют против 0,01 M трис-НС1 буфера рН 7,3 и пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (бх12,5 см), уравновешенной этим же буфером. Затем раствор фермента вносят в колонку с KM-целлюлозой (4х10 см), уравновешенной 0,02 M трис-НС1 буфером, рН 7,3. Элюируют рибонуклеазу прямолинейным градиентом хлористого натрия (0-0,5 М) в 0,02 М трис-НС1 рН 7,3 со скоростью 85 мл/ч. Получают 140 мл раствора фермента с удельной активностью 32000 ед/А =1, степенью очистки в 20 8000 раз и выходом по активности 57Х. Пример 3. К 15 7 л фильтрата культуральной жидкости Tr. harzianum 01 с активностью 30 ед/мл после подкисления до рН 5,0 2 М соляной кисло-25 той для сорбции в статических условиях прибавляют 0,75 кг влажной KMцеллюлозы, предварительно уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером, рН 5, 1, перемешивают 30 мин при комнатной температуре и отделяют сорбент фильтрованием на вакуум-фильтре. К полученному таким образом фильтрату прибавляют еще 0,75 кг влажной КМцеллюлозы, перемешивают 30 мин и 35 фильтруют. Обе порции сорбента взмучивают в 0,01 М ацетатном буфере рН 5, 1 и вносят в колонку (7,8х60 см) . Далее сорбент промывают 5 л буфера и элюируют фермент 0,25 М трис-HCl буфером рН 7,3, содержащим 1 M хлористого натрия. Раствор фермента диалиэуют против 0,01 М трис-НС1 буфера рН 7,3 и пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (4х17 см) со ско, 45 ростью 500 мл/ч ° Затем проводят хроматографию на КМ-целлюлозе в колонке (1,8х7,6 см). Элюцию осуществляют двумя градиентами со скоростью 70 мл/ч. Вначале используют прямолинейный градиент буфера (0,01-0,05 М, объем сосудов 150 мп), а затем градиент хлористого натрия (0,0-0,2 М) в 0,05 M трис-НС1 буфере рН 7,3. Фермент элюируют 0,1 M раствором хлористого натрия, Получают 33 мл раствора 55 фермента с удельной активностью 4500 ед/А>» =1 и выходом по активности 547. В таблице приведены результаты очистки, описанные в примерах 1-3, а также еще двух очисток (опыты 5,6), н которых использовались иные ус вия, и результаты оказались значительно хуже. Преимущество предлагаемого способа заключается в получении достаточно простым методом гуанилрибонуклеаэы со щелочными свойствами высокой удельной активности от 2860 до 4500 ед/мл и выходом от 48 до 543, включающем всего три этапа. очистки, причем первый этап очистки при использовании сорбции в статике значительно сокращается, а хроматография на ДЭЛЭ-целлюлозе сводится к простой фильтрации путем пропускания раствора фермента через соответствующую колонку. Гуанилрибонуклеаза, являющаяся щелочным белком, в отличие от РНКазы С легко отделяется от кислых продуктов ее действия сорбцией на катионитах и легче иммобилизуется традиционными способами, Формула изобретения Способ выделения и очистки внеклеточной гуанилрибонуклеазы Trichoderma harzianum 0 1, заключающийпя в хроматографии фильтрата культуральной жидкости íà KM-целлюлозе при рН 5,0-7,3, сорбции фермента в статике или динамике и элюции фермента с КИцеллюлозы ступенчатым градиентом 0,2-0,5 М ацетата натрия или 0,25 М трис-НС1 с 1,0 И хлористым натрием, или градиентом 0,01-0,5 М ацетатноаммиачного буфера, полученные активные фракции подвергают диализу против 0,0 1-0,02 М трис-НС1 буфера с рН 7,37,7 и очистке на ДЭАЭ-целлюлозе в том же буфере, с последующей хроматографией на КМ-целлюлозе, при этом для элюции используют 0,5 М ацетатноаммиачный буфер или линейный градиент 0,01-0,5 М хлористого натрия в 0,02 М трис-НС1 буфере, или последовательно два градиента: вначале линейный градиент трис-НС1 0,0 1-0,05 М, а затем линейный градиент хлористого натрия 0,01-0,2 М в трис-НС1 буфере. ОТТ Поыезетель а «а а» 2 (Э А ааеРВяяйа МРОЫЕТОЕPeáffff ЫЕ KN-ЦЕЛЛЯОЛОЗЕЯ Сорбцыл 6 я - АцетФР» Фзсфет аае .) аРзсфетЯВЯ f f feA АцетотчоЯияеычыый) АЫЕ а ЕТЫОеиъоияч ыьоя 0,О> 0,01 Цазааад ЧОС а я";Орые лредх3 Счаа" Стулеы= ч Ото Второй: лропусыеыые через ДЗАВ-целлзячозу 7,Э Î,ОJ О,О7 О,О;: 7petffAf ыроеятотрефыы ые Кицеллют озе Сорбцыы 7,Э 6яЗ трыс-ИС1 И уf:.„p Ацетытыо" еммыечиьЯ О,О) О,О> 0,02 0,0f 0,О1 Ояо) ИОЛЛарЫОСТЗ Сор11е Рреааыаааа1 Е СтулеычетвзЭ Стулеы ЧЕТачй НряиОлы ffe A ffldA ПрыыолыыейыыЧ i r 75fi Оя5 И яцетяю4. ИОС1 (О-Оя5 и) е трыс-НС1 1)0,01- 0,01Оя05 05 И трыс ИС1 7,Э 6я5 6 е а аал. I ffff 2660 ЭгОО Составитель В.Соина Техред 11. дидьд< Корректор С, 1Иекмар а Редактор H. Киштулинец Заказ 18о8/ЗО Тираж 520 Подписное В11ИИПИ Государственного комитета СССР во делам изобретений и открытий 113035 Иосква, Ж-35, Раушская наб„, д. А/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная,, 4 Ирл ыьлыцейыьй О 0 -Оя5 И ецет- евеФ ЬяЭ C f yffeffЧОТЪЯ О 2 ы О 5 И ецетете Иа 7я4-7я6 СтулеыЧЯТНЙ 0,25 трысНС1ы)И ИОС1 2) ИОС1 (О-0f 281 е Оя05 и трыс-ИС1 я ри 7,3 ПР ыачблця ыейыъЯ 0,0)-0.,5 И фоська 6яЬ g аУЧЕЫа,:. Ч Е ТТХю! Оя5 И яЯуосба, я9
