Способ получения цитотоксических к раковым клеткам лимфоцитов и способ получения гликосвязанного антигена

 

Изобретение относится к иммунологии и онкологии. Цель изобретения повьшение противораковой активности лимфоцитов. Раковые клетки промьшают и обрабатывают буфером, содержащим . Тритон Х-100. Смесь подвергают ультрацентрифугированию. Супернатант .пропускают через колонку, заполненную иммобилизованным лектином. После промьшки колонки проводят элюирование. Элюат диализуют и получают гликосвязанный антиген. Лимфоциты из селезенки мыши после обработки культуральной средой добавляют к гликосвязанному антигену и культивируют в течение 2 дней. Затем в течений 7 дней проводят культивирование в среде, содержащей фактор роста Т-клеток. Способ позволяет повысить цитотоксическую активность лимфоцитов против раковых клеток до 38%. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ CCCP

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н гщткнтм (21) 3465352/28-14 (22) 08.07.82 (31) 156413/81 (32) 01. 10. 81 (33) ЛР (46) 23 . 07. 88. Бюл. Р 27 (71) Оцука Фармасьютикал Ко., Лтд (JP) (72) Иацакацу Адаси (JP) (53) 615.373(088.8) (56) Sdand J. Immunol. 1980, 12, с. 149-154.

Иммунологические методы./Под ред.

Х.Фримеля. И.: Мир, 1979, с. 248-256; (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ

К РАКОВЫИ KJIETKAN ЛИИФОЦИТОВ И СПОСОБ

ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОСВЯЗАННОГО .АНТИГЕНА (57) Изобретение. относится к иммунологии и онкологии. Цель изобретения—

„„SU „„1412596 (51) 4 А 61 К 39/00 повышение противораковой активности лимфоцитов. Раковые клетки промывают и обрабатывают буфером; содержащим .

"Тритон X-100". Смесь подвергают ультрацентрифугированию. Супернатант ,пропускают через колонку, заполненную нммобилизованным лектином. После промывки колонки проводят элюирование. Элюат диализуют и получают гликосвязанный антиген ° Лимфоциты из селезенки мыши после обработки культуральной средой добавляют к гликосвязанному антигену и культивируют в течение 2 дней. Затем в течений 7 дней проводят культивирование в среде, содержащей фактор роста Т-клеток.

Способ позволяет повысить цитотоксическую активность лимфоцитов против раковых клеток до 38Х. 2 с. и 1 s.n. ф-лы, 2 табл.

1412596

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и онкологии, и может быть использовано при. получении цитотоксических к раковым клеткам лимфоцитов и при получении гликосвязанного антигена (GRA) для сенсибилизации лимфоцитов, направленных против опухолевых клеток, содержащих гликосвязанный антиген.

Цель изобретения — повышение противораковой активности лимфоцитов.

Пример 1. Получение фактора роста Т-клеток (препарата ТССР).

Селезенку (4 кг) японских обезьян, 15 полученных от компании Japan Р1утпаtes Co. Ltd подвергают иссечению и дважды промывают культуральной средой

RPMI-1640. Промытые клетки отфильтровывают с помощью ультрафильтра (раз в 20 мер пор равен 150 меш) и подвергают центрифугированию по методу удельновесового центрифугирования (удельный вес 1,076), в результате чего получают 2 л 2 10 на 1 мл лимфоцитов. Полу-,. ченные таким образом лимфоциты промывают три раза культуральной средой

RPMI-1640 и концентрацию лимфоцитов доводят,цо 5 ° 10 на 1 мл путем ис7 пользования той же среды, содержащей ЗО

10X FCS. Затем эту систему оставляют в аппарате для ферментации в ат0 мосфере углекислого газа при 37 С на период, равный 1 ч. Супернатантные (недосадочные) лимфоциты выделяют и доводят концентрацию (число) лимфоцитов до 1 ° 10 на 1 мл путем

6 использования той же культуральной среды, содержащей 1% FCS, После этого туда добавляют 1 мкг/мл индомета- рр цина и 0,2% РНА-Р (РНА — фитогемагглютинин) и лимфоциты культивируют в ферментационном аппарате в атмосфере углекислого газа при 37 С в течение 48 ч. Далее проводят операцию отделения с помощью центрифугирования (3000 об/мин), которое продолжают в течение 10 мин, полученную в итоге супернатантную жидкую фазу отделяют и подвергают стерилизации посредством фильтрования через ультрафильтр (диаметр пор равен 0,2 мк), в результате чего получают 2 л фактора роста Т-клеток (TCGF) .

Источник / TCGF представляет собой супернатант смешанных культур лимфоцитов периферической крови от

10 здоровых доноров. Неприкрепившиеся лимфоциты,полученные из С.Р, отделенных адсорбцией,на пластмассовой поверхности при 37 С в течение

1 ч, суспендируют в среде RPMI-1640, содержащей 1% РСБ (1,5 .10 клеток/мл) и инкубируют с 0,2Х íûì РНА-Р, индометацином (1 мг/мл) и линией  †клеток человека /ВТ-1) (1,5 10 клеток/мл), предварительно обработанных митомицином С (50 мг/мп). По прошествии 48 ч супернатант культуры собирают и используют в качестве источника ТССР.

Получение лимфоцитов периферической крови человека.

50 мл крови, полученной от здорового взрослого человека или различных раковых больных посредством гепаринизации, подвергают центрифугированию путем использования "Фиколла" (Ficoll Pack), в результате чего получают 5 .10 > лимфоцитов периферической крови человека.

Получение лимфоцитов из селезенки мыши.

Селезенку мьш ей породы СЗН (самцы, 6W) подвергают иссечению и дважды промывают культуральной средой

RPMI-1640, Затем ткань селезенки раз- . рыхляют иглой шприца и пропускают через сито иэ нержавеющей стали (100 меш) с целью удаления крупных, кусочков. Отфильтрованные таким образом клетки дважды промывают той же культуральной средой и подвергают центрифугированию при 1200 об/мин в течение 10 мин, в результате чего получают 4 ° 10 лимфоцитов селезенки, 7

Гликосвяз анный антиген (GRA-1), содержащий белка 40 мкг/мл и сахара

7,5 мкг/мл, разбавляют в 1000 раэ по сравнению с первоначальным объемом культуральной средой RPMI-1 640, содержащей 15% FCS, с целью получения сенсибилизационной культуральной срс:ды.

Лимфоциты периферической крови человека (5 10 /5 мл) прибавляют к

5 мл сенсибилизационной культуральной среды, которую помещают в лабораторную чашку Петри, и культивируют о при 37 С в течение 2 дней. Затем лимфоциты подвергают дальнейшей культивации в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 20% ТССР (фактор роста

T-клеток) и 15% FCS, еще в течение ,5 дней, в результате чего получают

20 мл раствора клеток-киллеров

14125 (GRA-1-К- T), содержащего 1 у 10 клеток-киллеров/мл, Пример 2, Лимфоциты из селезенки мыши подвергают обработке культуральной средой RPMI-1640, содержащей 15 FCS с целью доведения числа лимфоцитов до 5 10 на 1 мл.

Затем к этим лимфоцитам добавляют гликосвяэанный антиген (СВА-M-I), со- 1ð держащий 156 мкг белка и 94 мкг сахара, причем прибавление осуществляют таким образом, чтобы конечное количество белка и сахара составляло

1,5 мкг/мл и 0,9 мкг/мл соответст- 15 венно. 5-миллилитровую порцию полученной смеси культивируют в лабораторной чашке для культивирования клеток (60 15 мм) при 37 С в течение

2 дней. При этом наблюдается образо- 20 ванне клонов (клонирование). Затем эту порцию культивируют в культуральной среде RPMI †16, имеющей 15 FCS и содержащей 20 . по объему препарата .ТССР дополнительно в течение 7 дней 25 г до получения 50 мл раствора клеток .иллеров (GRA-M-I-К- T), содержащего

1а10 клеток-киллеров/мл.

Пример 3. Лимфоциты периферической крови (5 10 ) здорового до.—

6 нора инкубируют в среде RPMI-1640, содержащей 1 нг/мл (содержание белка)

СНА-2 и 15 РСБ при 37 С. На второй день к среде добавляют TCGF человека до тех пор, пока концентрация не достигнет 20, и продолжают инкубирование еще в течение 2 дней для получения киллерных клеток (GRA — 2-K/Ò).

Пример 4, Препараты киллерных клеток GRA-8-К-Т, СНА-3 — А-К-Т и 4р

GRA-3-С-К-Т получают таким же способом, как в примере 1 с использованием GRA-8, GRA-3-А и GRA-3-С соответ; ственно (содержание белков) 1000 нг/мл.

Пример 5, Мышам СЗН/Не (сам;. 45 ка, 8 недель) пересаживают внутрикож- но клетки Х5563 (10 ) того же штамЧ ма, и по истечению 7 дней опухоль извлекают хирургическим путем. Еще через 7 дней прививают клетки Х5563 (10 ) того же штамма, и мьппи, устойчивые к прививкам, названы иммунными мьппами.

Клетки селезенки иммунных мышей и нормальных мышей СЗН/Не получают

55 с помощью обычного метода.

Каждую партию клеток селезенки (5 ° 10, лунку) сенсибилизируют

40 нг/мл (содержание белка) СНА-М 5

96 4 в среде RPMI-1640, содержащей 15 .

FCS, в течение 5 дней для получения киллерных клеток.

Препарат киллерных клеток, полученных из нормальных клеток селезенки, обозначается GRA-M-5-К-Т-I, а препарат, полученный иэ клеток селезенки иммунных мышей, обозначается

GRA-5-К-Т-2.

Пример 6. Лимфоциты периферической крови человека (5.10 ) ин6 кубируют в 5 мл RPMI-1640, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание)

GRA-1,при 37 С в течение 2 дней.

Иа третий день лимфоциты переносят в среду ЕРМТ-1640, содержащую 10 .— ную сыворотку от донора лимфоцитов и от 0 до 100 нг/мл (белковое содержание) GRA-1,и продолжают инкубирование еще в течение 5 дней для получения препаратов киллерных клеток.

Пример 7. Лимфоциты периферической крови (PBL), взятые у различных раковых больных после операции, сенсибилизируют GRA-3 с получением препаратов киллерных клеток.

PBL (5-10 ), взятые у больных, ин6 кубируют в среде RPMI-1640, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание)

GRA 3, в течение 2 дней, а затем в среде RPMI-1640, содержащей 20 .

TCGF и 15 ГСБ, еще в течение 5 дней для получения киллерных клеток.

РВ . (5v10 ), собранные у больных раком груди по прошествии 21 дня после операции, инкубируют в среде

RPMI †16, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-3 и 10N-ную сыворотку, взятую у пациентов, в течение 7 дней для сенсибилиэации PBL и получения препарата киллерных клеток (GRA-3-К-T-7).

Для выявления противораковой активности препарат GRA-M-I разбавляют физиологическим солевым раствором так, чтобы количество сахара и белка составляли соответственно 1,0 мкг/мл и 1,6 мкг/мл с целью получения противоракового агента.

Злокачественную опухоль, развившуюся у мьппки СЗН/Не в результате апонтанно возникшего рака молочной железы, вырезают в стерильных условиях, разрезают на 5-миллиметровые кусочки кубической формы и трансплантируют (пересаживают) под кожу спины каждой из десяти подопытных мышек

СЗН/Не той же линии, что и мышка-до5 14125 нор (группу подопытных животных составляли самцы в возрасте 7 недель).

Через 7 дней после трансплантации . констатируют приживление и разрастание (пролиферацию) опухоли у всех

5 подопытных мышек. Каждой из пяти мышек вводят затем подкожно противораковый агент. Введение препарата осуществляют в дозе 300 мкл в день с ин- 10 тервалами в два дня. Оставшихся пятерых мышек используют в качестве контрольных животных, не подвергшихся лечению. Спустя десять дней после первого введения препарата у всех животных вырезают опухоль (оперативным путем) и замеряют средний вес опухоли в каждой группе животных.

Одновременно производят патогистологическое исследование. 20

Данные свидетельствуют о том, что в результате лечения произошло уменьшение размеров опухоли на 86,3 .

Результаты патогистологического исследования. 25

У мышек контрольной группы тело опухоли приобрело форму птичьего гнезда, тип ткани был подобен медуллярному каналикулярному раку (раку спинно-мозгового канала), причем раэ- 30 множение опухолевых клеток наблюдалось по всей ткани. В группе мышек, которым вводили противораковый агент, раковые клетки вызывали раэжижительный некроз в местах, где образовались раковые клетки. При этом происходила кальцификация и фибрикация (образование волокон), оставляя лишь очень ограниченное количество раковых клеток. Таким образом, в этом экспери40 менте наблюдалось отчетливое противоопухолевое действие противоракового агента изобретения.

Препарат GRA-I-К-Т (1 мкл) поместили на микропластинку и оставили при комнатной температуре на 15 мин.

Затем туда добавили 4 мкл FCS и смесь оставили стоять при комнатной температуре в течение 30 мин. Обработанные ферментом нейраминидазой красные кровяные клетки (эритроциты) овцы (SRBCN) довели до концентрации i х х 10 клеток/мл и добавили 5 мкл

0,01 М фосфатного буфера (рН 7,2), содержащего 0,85Z NaCl, после чего пластинку подвергли процедуре разделения с помощью центрифугирования при скорости 600 об/мин в течение

5 мин. Затем пластинку перевернули

96 и непрореагировавшие эритроциты SRBCN удалили. Для прокрашивания лимфоцитов систему обрабатывали раствором красителя "Брилльянт Крезил Блю" и затем исследовали степень развития положительной реакции розеткообразования (розеткообразующей позитивности). В результате было обнаружено, что по крайней мере 98Х клеток проявляет роэеткообраэующую позитивность (Т-клетки).

Проявление специфической киллерной активности в отношении раковых клеток, Использовали следующие пять клеточных штаммов, имеющих различные отношения позитивности GRA (GRA Positivivity ratios). Эти клеточные штаммы использовали в качестве мишеней раковых клеток человека, Раковые клетки-мишени:

ВТ- t (лимфома Буркитта)

Dandi (лимфома Буркитта)

КАТО-111 (рак желудка)

HKN-45 (рак желудка)

N0LT (Т-клеточная лейкемия)

На микропластинку нанесли с помощью процедуры центрифугирования при-, скорости 800 об/мин в течение 5 мин

Ф слой из 5 10 на источник мишеневых раковых клеток. Затем туда осторожно добавили 4 10 на источник клетоккиллеров GRA-I-K — T полученных по приме/ ру 1,и систему инкубировали в течение 1 ч.

Киллерную. активность определяли в соответствии со степенью образования зон гемолиза (пятен или бляшек-plaque-formation) и оценивали ее с помощью следующей системы оценок:

++ наблюдалась значительная киллерная активность;

1 наблюдалась выраженная киллерная активность; и наблюдалась слабо выраженная киллерная активность; — киллерной активности не наблюдалось.

В контрольной группе были использованы несенсибилиэированные лимфоциты периферической крови человека, которые получали тем же способом за исключением того, что в этом случае не использовали GRA, Данные показывают, что Т-клеткикиллеры, полученные по предлагаемому способу, обладают сильной GRA-cne1412596

- Р

Специфическое высвобождение Cr = (Высвобождение при испытании) — (Самопроизвольное высвобождение) х 100 (Максимальное высвобождение) — (Самопроизвольное высвобождение) цифической ингибирующей активностью в отношении раковых клеток.

Пример 8 (сравнительный), В качестве специфических антигенов

5 для использования в предлагаемом способе вместо GRA были использованы сами раковые клетки (per se).

Лимфопиты, сенсибилиэированные раковыми клетками, были получены аналогично примеру 1, с той только разницей, что вместо GRA были использованы раковые клетки ВТ-1, Dandi, КАТО-111 или NKN-45 в дозе 1 ° 10 клеток на лабораторную чашку, 15

При использовании полученных таким образом лимфоцитов проводили исследование их цитотоксической актив. ности по той же методике. Полученные результаты представлены в табл. 1. 20

Как видно из табл..1, приготовленные лимфоциты не обладали какой-либо цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам-мишеням., Максимальное высвобождение обозна- 30 чает радиоактивность, при которой все клетки лизированы.

При использовании в качестве мишени клеток КАТО-IjI, меченых Cr наблюдалось специфическое высвобождение Cr, равное 14,37 (E/Т = 20/1)

Пример 9. Получение GRA.

Иммобилизованный лектин (PNA-Sepharose) получают следующим образом.

3 г CNBr-активированной Сефарозы 4В тщательно промывают 1 мм раствором соляной кислоты и суспендируют в

200 мл 0,1 М раствора бикарбоната натрия (рН 8,5), Затем к полученной суспензии прибавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 8,5), содержа45 щего 20 мг арахисового лектина (PNA), и смесь оставляют реагировать в условиях периодического перемешивания

О при 25 С на период, равный 2 ч, с целью получения иммобилизованного препарата лектина (PNA-Sepharose).

Аналогично, за исключением того, что вместо PNA испольэовали DBA (агглютинин бобов Долихас), получили

DBA-Сефарозу. 55

Получение GRA.

Раковые клетки ВТ-1 (лимфомы Буркитта, 1,3 10 клеток) промывают

Цитотоксичность каждого из препаратов киллерных клеток определяли с помощью теста на высвобождение Cr.

А именно, 50@ Ci радиоактивного Cr

54 (Японская Ассоциация Изотопов) добавляли к КАТО-111 (2 10 ) и клетки инкубировали при 37 С в течение 1 ч в

cveae RPMI-1640, промывали при центрифугирований с получением клеток мишеней,меченных Cr.Ê клеткам-мишеням (1 ° 10 ) добавляли киллерные клетки (эффекторные клетки, 2 ° 10 ) таким

6 образом, чтобы Е/Т = 20/1, смесь инкубировали при 37 С в течение 4 ч в среде КРИТ-1640. Супернатант собирали с помощью центрифугирования, определяли его радикальность в жидкостном счетчике-сцинцилляторе.

Специфическое высвобождение Cr (7), соответствующее цитолитической активности эффекторных клеток, вычисляли по следующей формуле:

3 раза физиологическим солевым раствором и прибавляют 30 мл 0,01 М буфера трис-соляная кислота (рН 7,4), содержащего 27. эмульгатора "Тритоп

Х-.100"; 0,857 NaC1 2 мМ CaCle u

2 мМ хлористого магния. Полученную о смесь перемешивают при 4 С в течение

15 мин и затем подвергают ультрацентрифугированию при 100000 g. Из 28 мл полученной таким образом надосадочной жидкости (супернатанта) 14-миллилитровую порцию пропускают через колонку (диаметром 0,5 см и длиной

1 см) для аффинной хроматографии, набитую сферическими гранулами иммобилизованного на агарозе лектина (PNA-Sepharose), которую уравновешивают трис-солянокислым буфером (рН 7,4),. содержащим 0,17 "Тритона Х-100", 0,857 NaC1, 2 мМ СаС1 и 2 мМ МаС1

После промывки колонки тем же буфером ее элюируют 0,01 М трис-солянокислым буфером (рН 7,4), содержащим

О, 1 M лактозы, 0,857 NaC1, 2 мМ СаС1, 2 мМ МяС1 и О, 17 "Тритона Х-100".

Элюированную таким образом порцию диализуют против 0,01 М трис-солянокислого буфера, содержащего 0,857

NaCl 2 мМ CaCla v 2 мМ Ifgcl в течение 48 ч, в результате чего получают 17 мл раствора GRA, Количество белка и количество сахара (углеводов) в этом растворе GRA измеряют по ме-,тоду Фолина-Лоури (концентрация бел5 ка) и по методу, основанному на ис" пользовании системы фенолсерная кис.— лота (концентрация сахара). При этом было найдено, что в растворе GRA содержание белка составило 644 мкг, а 10 содержание сахара — 120 мкг соответственно. Этот препарат (раствор GRA) будет именоваться "GRA-1, Клетки рака молочной железы (ММТ) мьппи СЗН/Не (1 ° 10 клеток) промывают

<и

3 раз а физиологич еским сол евым растI вором, после чего обрабатывают их

30 мл 0,01 М трис-солянокислого буфера (pH 7,4), содержащего 2 "Тритона Х-l00", 0,85Х NaC1 2 MM CaC1> и

2 мМ хлорида магния. Полученную смесь перемешивают при 4 С в течение 30 мины

После этого смесь центрифугируют на ультрацентрифуге при 100000 g в течение. 2 ч и полученный супернатант диа- 25 лизуют в течение ночи против О, 1 M .. трис-солянокислого буфера (рН 7,4); содержащего 0,85Х NaC1, 2 мМ СаС1о и 2 мМ MgCI Диализованную таким образом жидкость сконцентрируют до . Sp объема, равного 3 мл, и 1-миллилитровую порцию этого раствора пропускают через колонку (диаметром О;5 и длиной 2 см) для аффинной хроматографии, заполненную.тем же иммобили— зованным на Сефарозе лектином (PNA—

Sepharose), уравновешенную трис-солянокислым буфером (рН 7,4), содержащим 0,005 "Тритона Х-100" 0,85

NaC1, 2 мМ СаС1 и 2 мИ МяС1 . После тщательной промывки колонки тем же буфером ее элюировали 0,01 М трис-солянокислым буфером (рН 7,4), содержащим О, 1 М лактозы, 0,85 ИаС1, 2 мМ СаС1, 2 мМ MgCI и 0,005 . "Три- 45 тона Х-100", и полученный таким образом элюат диалиэуют в течение 48 ч против 0,01 И трис-солянокислого буфера (pH 7,4), содержащего 0,85

NaC1, 2 мМ СаС1 и 2 мМ MgC1>, в результате чего получают 2 мл раствора

GRA. В полученном таким образом раст-. воре GRA содержалось 156 мкг белка и 94 мкг сахара, Этот препарат будет именоваться GRA-M-I, Примерно 120 г. (влажного веса)

КАТО-111 гомогенизируют в 100 мл PBS с помощью размельчителя Варинга. После центрифугирования при 100000 g

1412596 l0 в течение 1 ч таблетку растворяют B

100 мл 2 -ного "Тритона Х-100" в

0,01 M буфере трис-НС1 (рН 7,6), содержащем О, 15 M МаС1. После центрифугирования при 100000 g в течение

1 ч собирают супернатант и наносят его на колонку PNA-Сефарозы 4В (0,8 х х 15 см), уравновешенную 0,015 -ным

"Тритоном Х-100" в 0,01 M трис-НС1 (pH 7,6), содержащем 0,15 M NaC1. После промывания 50 мл буфера СНА элюируют буфером, содержащим 0,1 М лакTosbl Элюированный GRA диалиэуют против 0,85 NaCI концентрируют с помощью Сефадекс Pharmacia Со. и.хранят о при -20 С до.использования.

Обнаружили, что содержание белка и сахара, определенное таким же способом, составляло 2,0 мг и 0,8 мг соответственно. Этот препарат будет называться GRA-2.

Аналогично получали другие пробы

СНА (табл. 2).

Аналогично, кроме того, использовали клеточную линию (MKN-45, около

29 r) вместо КАТО-III, вместо PNAСефарозы 4В использовали DBA-Сефарозу, проводили элюирование с помощькГ

N-ацетилгалактозамина, получали препарат GRA содержание белка в котором составляло 0,03 мг, а содержание сахара составляло 0,01 мг. Это препарат GRA-8, Локализация (местонахождение) GRA.

Получение FITC-меченого лектина (PNA-FITC) . 10 мг арахисового.лектина растворяют в 2 мл 0,01 М фосфатного буфера, содержащего 0,85 . NaC1 (рН 7,2). В 1 мл 0,5 M бикарбонатного буфера (pH 9,0) растворяют 2 мг

FITC, 0,5-миллилитровую порцию полученного раствора прибавляют к ранее приготовленному раствору арахисового лектина в фосфатном буфере. Далее эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего наносят на колонку с "Сефадексом

G-25". (стандартная колонка диаметром

10 мм и длиной 300 мм) и подвергают разделениюо собирая фракцию, соответствующую начальному пику. Отношение

FITC/PNA = i 0.

Получение лектина, меченого FITC (DBA-FITC) DBA-FITC получали с использованием DBA. FITC/DBA =

= 0,9.

Агглютинин соевых бобов — FITC (FITC-$ВА) соотношение РТТС/SBA = 1,4.

Таблица

Клеткимишени

ВТ-1

Dandi

КАТО-111

MKN-45

Таблица 2

GRA Содержание белка сахара, мг

Содержание, мг

Проба GRA

0,5

0,9

GRA-3

GRA-4

GRA-5

ВТ-1

Рак груди 5 х

QG-56 24

0,24

0,5

0,6

0,38

11 14125

Локализация СВА в различных раковых клетках.

Раковые клетки культуры ткани человека (1 ° 10 ) промывают 3 раза 0,05 М

5 буферным раствором трис-соляная кислота, содержащим 0,85 хлорида нат,, рия (рН 7,2), используя для этого процедуру центрифугирования, после чего прибавляют к ним 100 мкл FITC-меченого лектина (PNa-FITC DBA-FITC или

SBA-FITC 200 мкг/мл, приготовленного, как описано, Полученную смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение

30 мин для протекания реакции. После завершения реакции указанную реакционную смесь трижды промывают 0,01 M фосфатным буфером, содержащим 0,85

NaC1 (рН 7,2), после чего промытые клетки помещают на стеклянную пластинку и исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа.

Злокачественные ткани, взятые у раковых больных, пропускают через 25 сетку из нержавеющей стали (ф 150) для получения суспензии единичных клеток. После двукратного промывания .буфером 0,01 M трис-НС1 (pH 7,4), содержащим 2 мМ СаС1, 2 мМ МдС1 30 и 0,85 NaC1 5 10 клеток, повторно

5 суспендируют в 100 мл буфера. 100 мл

FITC-PNA или FITC-SBA (200 мг/мл) добавляют к этой клеточной суспензии, и смесь выдерживают при комнатной температуре 20,мин После трехкратного промывания холодным PBS клетки наблюдают под флуоресцентным микроскопом, Таким образом, предлагаемый способ 4о позволяет повысить цитотоксическую активность лимфоцитов против раковых клерк за счет использования GRA no1

У лученного из компонентов раковых клеток, при этом активность лимфоци- 4В тов возрастает до 38 цитотоксичности и более.

Источник Количество, г

12

Формула изобретения

1. Способ получения цитотоксических к раковым клеткам лимфоцитов, включающий сенсибилизацию лимфоцитов противораковым антигеном, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения противораковой активности лимфоцитов, в качестве противоракового антигена используют гликосвязанный антиген в количестве 1-1000 нг/мл на (1-5) 10 лимфоцитов и сенсибили6 зируют лимфоциты в течение 2-7 сут.

2. Способ получения гликосвязанного антигена путем гомогенизации или солюбилизации раковых клеток человека или мощи,. отличающийся тем, что, с целью повышения противо" раковой активности лимфоцитов, дополнительно компоненты клеточных мембран обрабатывают лектином с последующим выделением лектина и гликосвязанного антигена.

3, Способ по и, 2, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве лектина используют арахисовый лецитин и агглютинин из бобов Долихос. аковые клетки, использовавшиеся для сенсибилизации лимфоцитов

T-1 Dandi КАТО-111 МКИ-45

1412596 и чиик Еолнчес

0,54

0,45

0,78

28,4

200

11,3

GRA-M-2

GRA-M-3 LLC

GRA-M-4 МН-1 34

0,07

0,06

14,4

0 35

0,65

0,23

GRA-M-5 Х-5563

0,56

Извлеченный хирургическим путем.

Редактор Н.Бобкова

Корректор С.Шекмар

Подписное

Заказ 3678/59

Тираж 655

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4.

GRA-6

GRA-7

QG-90

Raji

Составитель Г.Крюкова

Техред М.Ходанич

l4

Продолжение табл, 2

Сод ераание сажарв ° мг