Способ получения cu,zn-супероксиддисмутазы из животного сырья

 

Предлагается способ препаративного выделения из животных тканей (печень, почки, легкие, сердце,мозг) Си,гп-супероксвддисмутазы (СОД). Цель изобретения - повьшение выхода целевого продукта, универсальности способа. Изобретение заключается в том, что рН гомогената тканей, полученного смешиванием ацетонового порошка с 0,1 М калийфосфатным буфером, доводят до рН зтом нерастворимые части гомогената осаждают центрифугированием при, 6000 xg (20 мин) вместо до 20000 х g (40 мин). Затем проводят осаждение белка сульфатом аммония с добавлением ацетона (двадцатикратно меньшим объемом). В ре-, зультате этого происходит быстрое саморазделение белковой фракции с уменьшением объема в 10-12 pas. При этом белковый осадок собирают центрифугированием при 3000 X g (15.мин)вместо до 6000 X g (40 мин) в известном, Дапьг нейшая очистка белка включает обработку ион-обменной хроматографией и гель-фильтрацией. Способ дает возможность обрабатьшать в лабораторных условиях до 30 кг ткани с хорошим выходом (65-67%) получения фермента в сравнительно короткое время (в течение 3 дней) с использованием несложных оборудований и недорогостоящих - недифицитных реактивов. Причем использованные реактивы (ацетон, ионобменники, сефадексы) регенерируют. (Л 4аь 9 СО 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Ц11 4 С 12 И 9/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И АВ OPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4120942/31-13 (22) 14.07.86 (46) 30,07.88. Бюл. 11 28 (71) Институт биохимии АН АрмССР (72) И.А.Симонян . (53) 577.15(088.8) (56) Marklund S,Н, et.al.Mutation Res ч. 148, и. 1/2, 1985, р.129.

Albergoni.V.et.al.Comp.Biochem

Biophys v, 47 1974, р. 767.

Григорян Н.А. и др. Очистка и срав нительное изучение свойств. СОД иэ животных тканей. — Биохимия, т.42, У 8, 1977. с.1499-1504. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Cu, Zn-СУПЕРОКСИДЦИСМУТАЗЫ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ (57) Предлагается способ препаративного выделения из животных тканей (печень, почки, легкие, сердце, мозг)

Cu,Zn-супероксиддисмутазы (СОД).

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта, универсальности способа, Изобретение заключается в том, что рН гомогената тканей, полученного смешиванием ацетонового по„„Я0„„1413133 А 1 рошка с 0,1 М калийфосфатным буфером, доводят до рН 5-7, при этом нерастворимые части гомогената осаждают центрифугированием при 6000 x g (20 мин) вместо до 20000 х g (40 мин). Затем проводят осаждение белка сульфатом аммония с добавлением ацетона (двадцатикратно меньшим объемом). В ре». эультате этого происходит быстрое самораэделение белковой фракции с уменьшением объема в 10-12 раз. При этом белковый осадок собирают центрифугированием при 3000 х g (15 мин) вместо до

6000 х g (40 мин) в известном. Даль. нейшая очистка белка включает o6pa"бо тку ион-обменной хроматографией и гель-фильтрацией. Способ дает возможность обрабатывать в лабораторных условиях до 30 кг ткани с хорошим выходом (65-672) получения фермента в сравнительно коротков время (в течение 3 дней) с использованием несложных оборудований и недорогостоящих— недифицитных реактивов. Причем использованные реактивы (ацетон, ионобменники, сефадексы) регенерируют, 141З1ЗЗ

Изобретение относится к биотехнологии и касается выделения Cu,Zn-супероксиддисмутазы (СОД) из печени, почек, легких, сердца и мозга крупного рогатого скота.

Цель изобретения — повышение вы« хода целевого продукта, упрощение и расширение функциональных возможностей способа. 10

Способ предусматривает проведение осаждения (удаления) нерастворимых частей гомогената при рН 5,7, так как прн этих условиях наблюдает1 ся оптимальное осаждение мутности 15 (прозрачность супернатанта 1001. } По-1 вышение предела рН приводит к частичному осаждению СОД (изоэлектрнческая точка которой равна 6,1), и неполно" му осаждению мутности (50K) а при понижении этого предела повышается риск денатурирования СОД, больше расходуется кислоты. Удаление мутности важно тем чтобы уменьшить деграУ

25 дацию СОД этими веществами, которые представляют мембраны и др. (перекиси липидов мембран). При рН 5,5 или б ! выход СОД уменьшается примерно на

10-12Х.

Количество добавляемого ацетона подобрано с таким расчетом, чтобы обеспечить полное и быстрое (в течение 20-30 мин) саморазделение белковой фракции от остальных частей раствора, Это количество ацетона оптималь-35 ное (в 20-кратно меньшем объеме).До1 бавление ацетона в больших количест вах (в 10-кратно меньшем объеме) фактически не влияет на выход полученного препарата и приводит к излишне- 40 му расходу этого реактива. При уменьшении количества добавленного ацетона (например, в 30-кратно меньшем . объеме) приводит к неполному и дли- . тельному разделению (в течение 3 ч) белковой Фракции, Предложенным способом полученный препарат СОД электрофоретически гомогенный (злефтрофорез проводили на

7Х-Hoì полиакриламидном геле, на котором была видна только одна полоса).

Дополнительным подтверждением гомогенности препарата служит критерий чистоты (оптический индекс чистоты): отношение поглощения при 680 нм и

260 нм, Арво /A » 35 ° Полу енн и препарат СОД имеет оптические и ЭПРспектры, мол.массу (32000 Да),идентичные препаратам, полученным из других источников. Активность полученного препарата супероксиддисмутазы, определенная по нитротетразолевому синему методу, составляет 3500-3800 ед/мг белка, Полученныи препарат имеет аналогичные формы спектров (свойства) имеющиеся у Cu, Zn-СОД, полученный другими способами (имеет максимумы поглощения при 260, 680 нм на оптическом спектре и Ац 140 Гс, g = 2,08 (фактор Ланде) по ЭПР-спектJ. рам. Таким образом„ предложенным способом получается препарат Cu, Zn-СОД с типичными физико-химическими свойствами и активностью4

Выделение СОД осуществляют следующим образом.

Ткань в количестве до 30 кг, гомо-; генизируют в двухкратно большем объеме ацетона с помощью раэмельчителей ткани при 8000 об/мин в течение 2 мин.

Собирают ацетоновый осадок центрифугированием при 3000 x g, 15 мин, его гомогенизируют в 0,1 М Фосфатном буфере, рН 7,4 (КФБ) и инкубируют полученную смесь при 10 С в течение

2 ч., прн интенсивном перемешивании,.

Затем рН этого гомогената приводят к

5,7 (0,5 M моляной кислоты) и удаляют нерастворимые части центрифугированием в течение 20 мин при 6000 х х g, К полученному надосадочному раствору добавляют сульфат аммония до насыщения и затем ацетон (в 20кратно меньшем объеме), смесь интенсивно перемешивают и оставляют в покое, Через 20-30 мин при 20 С происходит полное разделение белко" вой фракции от других компонентов смеси (белковая фракция в виде агрегата собирается на верхнем слое раствора и легко декантируется). При этом объем белковой фракции уменьшается в 10-12 раэ (без потери белка), собирают белковый осадок центрифугировванием 3000 x g, 20 мин, растворяют

его в воде. Затем удаляют центрифугированием фракцию, осажденную при

50Х-ном насыщении сульфатом аммония, и собирают СОД-содержащую фракцию: при 90Х-ном насыщении. После растворения этого осадка в воде ставят диалиэ против воды (на ночь). После диализа и удаления нерастворимых частей центрифугированием красно-зеленоватый супернатант пропускают через колонку с ДЭ-52 целлюлозой (размеры

1413133

20хб см), уравновешенную 0,04 М КФБ, рН 7,4. СОД элюирует 0,02 М КФБ и осаждают на колонке с ДЭАЭ А-50 сефадексом (15x6cM), уравновешенной этим же буфером. Далее эту колонку промывают 0,01 М буфером (1 л) и

СОД элюируют 0,2 М буфером. Затем полученный раствор СОД пропускают через сефадекс G-75 (120x4 см) и СОД (зеленого цвета) концентрируют на

ДЭ-52 целлюлозе (10х3 см).

После такой обработки получают электрофоретически гомогенный препарат Cu,Zn-супероксиддисмутазы, Вре- 15 мя работ, затраченное на процедуру вьделения и очистки СОД составляет

3 дня.

Способ позволяет обрабатывать ткани фактически в неорганических коли- 20 чествах (в лабораторных условиях до

30 кг ткани, при одном выделении) и получать высокоочищенный препарат

СОД, удельная активность которой со- ставляет 3800-4000 ед/мг белка за 25 единицу активности принимается то количество белка в мг, которое способно ингибировать на 507 процесс образования формазана при восстановлении нитросинего тетразоля супероксидными 30 анионами.

Выход чистого препарата СОД составляет в среднем 65-677 от исходного количества СОД в гомогенате. За одно вьделение в расчете на ) кг ткани предложенным способом можно получить из печени до 300 мг, почек—

200 мг, легких — 90 мг, сердца—

80 мг, мозга — 50 мг Cu, Zn-СОД.

Пример. Схема выделения и 40 очистки СОД из различных тканей жи.Bomoro происхождения.

Печень (30 кг), почки (30 кг), сердце (30 кг), легкие (30 кг), могз (30 кг). Гомогенизация в ацетоне 45 (2-кратный объем).

2. Гомогенизация ацетонового осадка в 0,1 М фосфатном буфере (3 объем) рН 7, 4, Инкуб ация смеси в течение 2 ч . при 10 С. 50

3, Понижение рН гомогената до рН 5,7 с добавлением 0,5 M НС1 и цент. рифугирование при 6000 об/мин, 20 мин.

4. Насыщение надосадочного раствора сульфатом аммония и добавление ацетона (в 20-кратно меньшем объеме) и сбор верхнего — белкового слоя,после центрифугирования при 3000 об/мин, 20 мин, осадок растворяют в воде.После центрифугирования (6000 об/мнн, 30 мин) к полученному надосадочному раствору добавляют сульфат аммония до 907 насьпцения и собирают оса» док центрифугированием при 6000 об/мин и растворяют в воде и ставят диализ против воды.

5. После центрифугирования диалиэата при 6000 об/мин супернатаит пропускают через колонку с ДЭ-52 целлю" лозой (20хб см), уравновешенной фосфатным буфером (рН 7,4).

6. СОД-фракцию (зеленую) элюируют

0,02 М буфером (рН 7,4).и пропускают через ДЭАЭ А-50 сефадекс (15хб см), СОД элюируют 0,2 М буфером, 7. Полученный СОД затем пропускают через С-75 (120х4 см) и выходящую

СОД концентрируют на ДЭ-52 целлюлозе (10х3 см).

8. Выход полученного гомогенного препарата СОД в расчете 1 кг,X: печени 67; почки 65; сердце бб; легкие 65; мозг 64; СОД-активность препарата, соответственно ед/мг 3900, .3800, 3800, 3700,3500.

Формула изобретения

Способ получения Cu Zn-супероксиддисмутазы из животного сырья, предусматривающий гомогенизацию сырья, в качестве которого используют печень, почки и мозг крупного рогатого скота, в ацетоне, получение.надосадочного раствора из гомогената, диалиэ про-, тив воды белковой фракции с последующей очисткой ионообменной хроматографией на ДЭ-52,"ДЭАЭ А-50 целлюлозе„ гель-фильтрацией на сефадексах G-75, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода целевого продукта, упрощения и расширения функциональных возможностей способа, в качестве исходного сырья дополнительно используют сердце и легкие крупного рогатого скота, величину рН гомогената доводят до 5,7 0,5 М соляной кислотой, нерастворимый осадок удаляют, осаждают белок из надосадочного раствора насыщением сульфатов аммония и добавлением ацетона в двад. цатикратно меньшем объеме,