Способ определения активности аргиназы мозга в сыворотке крови

 

Изобретение относится к биохимии . Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа при од- .новременной возможности длительного сохранения образцов. После обработки формальдегидом сьторотку крови наног ; сят на фильтровальную бумагу, высушивают , промьшают раствором хлористого калия и вновь высушивают. Обработанную опытную полоску с пробой и контрольную полоску погружают в раствор аргинина и в эти же пробирки вносят рабочий раствор для определения мочевины. Пробы ставят в кипящую водяную баню на 12 мин. В контрольные образцы аргинин вносят на 2-й минуте пребьшания их в бане. Затем пробы охлаждают и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре. 1 табл. с б (О

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) У

g1) 1 G Ol N 33/48, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

Н д BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4139847/28-14 (22) 28.10.86 (46) 30,07.88. Бюл. У 28 (71) 1-й Московский медицинский институт им. И.М. Сеченова и Научно-исследовательский институт неврологии .АМН СССР (72) У.Т. Хаджимухамедов, Т.С. Бас" каева, Т.Т. Реброва и Е.В,Храпова (53) 616.07(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 1359742, 1986. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

АРГИНАЗЫ МОЗГА В CbIBOPOTKE КРОВИ (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения — повышение точности и упрощение способа при одновременной возможности длительного сохранения образцов. После обработки формальдагидом сыворотку крови нано(.. сят на фильтровальную бумагу, высушивают, промывают раствором хлористого калия и вновь высушивают. Обработанную опытную полоску с пробой и контрольную полоску погружают в раствор аргинина и в эти же пробирки вносят рабочий раствор для определения мочевины. Пробы ставят в кипящую водяную баню на 12 мин. В контрольные образцы аргинин вносят на 2-й минуте пребывания их в бане. Затем пробы охлаждают и измеряют оптическую плот" а

® ность на спектрофотометре. 1 табл.

1413530

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимической диагностике и неврологии, и может быть использо.вано для диагностики заболеваний, обусловленных преимущественным поражением нейрона, в результате которого в биологических жидкостях появляется активность аргиназы мозга.

Цель изобретения — повышение точ- 10 ности и упрощение способа при одновременном обеспечении возможности длительного сохранения образцов.

Способ осуществляют следующим о разом. 15

0,02-0,05 мл (20-50 мкл) сыворотки .крови, предварительно обработанной раствором формальдегида до его конечной концентрации 0,15-0,3 мкМ, нано.— сят на фильтровальную бумагу, высуши" 20 вают при 40-60 С, 2-3 раза промывают 2Х-ным раствором хлористого калия с последующим высушиванием при той же температуре. Далее обработанную опытную полоску с пробой и контрольную полоску того же размера погружают в раствор аргинина (100 мкМ/мл) на

10 мин и в эти же пробирки вносят по 2 мл стандартного рабочего раствора для определения мочевины. Пробы 30 ставят в кипящую водяную баню на

12 мин. В контрольные образцы аргинин вносят на 2-й минуте пребывания их в бане. Затем пробы охлаждают (23 мин) под струей холодной Воды, из». 35 меряют оптическую плотность на спектрофотометре СФ-24 при длине волны

525 нм и выражают результат в единицах (1 ед равна мкМ/мин).

Всего обследовано 119 человек, 40 из них с диагнозом: острое нарушение мозгового кровообращения (OHNK) 69, преходящее нарушение мозгового кровообращения 4, гипертоническая знцефалопатия. (ГЭ) 11, начальные проявления 45 неполй@ценности мозгового кровообращения 4, артериальная гипертония (АГ) + начальные проявления неполноценности мозгового крообращения 2, АГ 6. Диагноз подтверждали данными

50 анамнеза, клинической картиной забо- левания, комплексом клинических и параклинических методов исследования с обязательным использованием компьютерной томографии.

Контрольная группа включает 23 человека, из них доноров 15, больных с рассеянным склерозом 4, остреохондрозом 4, Предлагаемый способ позволяет ре-: гистрировать появление специфической активности аргиназы мозга в сыворотке крови при острых нарушениях мозгового кровообращения и ГЭ.. О, специфичности предлагаемого способа можно судить из приведенных примеров.

Активность аргинаэы не определяли в сыворотке крови здоровых людей (доноры) и практически не наблюдали у неврологических больных с поражением других структур (см. таблицу).

Активность аргиназы, ед/л

Доноры

Рассеянный Остеохонсклероз дроз

0

2,5

Пример 1. Больная Л., 57 лет, диагноз: ограниченное кровоизлияние в глубокие отделы левого полушария, гипертоническая болезнь Ш ст.

Заболела 16.03.86,. когда внезапно развилась -слабость в правой руке и ноге, изменилась речь.

При поступлении: состояние средней тяжести, глазные щели ЭВЯ, правосторонний парез мимической мускулатуры, снижена сила в правой руке, объем движений полный, Отмечается повышение мышечного тонуса по пирамидному типу в правых конечностях.

Болевая чувствительность снижена с справа по гемитипу. Сухожильные реф" лексы повышены, справа больше, чем слева. Вызывается ладонно-подбородочный рефлекс с обеих сторон. Гипергидроэ, значительно усиливающийся при повышении АД, Нарушение речи по типу заикания.

Определяли активность аргиназы по следующей методике: сыворотку крови в количестве 20 мкл, предварительно обработанную раствором фор-. мальдегида до конечной концентрации

0,15 мкМ, наносили на фильтровальную бумагу, высушивали при 40 С, 2 раза промывали 2Х-ным раствором хлористого калия с последующим высушиванием при той же температуре. Далее опытную

1413530

4. полоску погружали в раствор аргинина на 10 мин и в эти же пробирки вносили по 2 мл рабочего раствора для определения мочевины. Затем пробы ставили в кипящую водяную баню на 12мин.

В контрольные образцы аргинин вносили на 2-й минуте пребывания их в бане. Затем пробы охлаждали и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-24 при длине волны.

525 нм.

Активность фермента в крови, определенная предлагаемым способом, составила 11 ед/л в первый день после 15

0НМК.

Поражение ЦНС подтверждено данными компьютерной томографии: в левом полушарии в проекции средне-задних отделов скорлупы была определена небольшая область интенсивно повышенной плотности, окруженная небольшой .областью пониженной плотности, что соответствует небопьшому кровоизлиянию в стадии организации описанной лока- 25 лизации.

Пример 2. Больной П., 59 лет, диагноз: кровоизлияние в правое полушарие головного мозга. При поступлении: сознание ясное, ориентирован на 3п месте и во времени, временами зевота, речь дизартрична. Некоторое снижение напряжения жевательной мускулатуры слева. Гипалгезия левой половины лица. Сглажена левая носогубная складка, Мягкое небо провисает, язычок уклоняется влево. При фонации небная занавеска сокращается несколько ограниченно. При высовывании языка он уклоняется влево. Движение в левой руке отсутствует, в локтевом суставе намек на сгибание, в ноге: выпрямленную ногу поднимает < 10 от постели, о поставленную ногу с опорой на пятку не удерживает,в голеностопном суставе 45 движений нет. Мышечный тонус умеренно повьппен в сгибателях и пронаторах левого предплечья, в разгибателях левой голени и приводящих мышцах бедра.

Сухожильные рефлексы вызываются 0Ъ$.

Брюшные рефлексы справа вызываются, 50 слева отсутствуют. Вызывается симптом

Бабинского слева. Вызывается ладонноподбородочный рефлекс. Отмечается левосторонняя гемигипестезия. Суставномышечное чувство: расстроено слева

55 во всех суставах, включая крупные.

Активность аргиназы определяли по следующей методике: сыворотку крови в количестве 50 мкл, предварительно обработанную раствором формальдегида до конечной концентрации 0,3 мкМ, наносили на фильтровальную бумагу, высушивали при 60, 2 раза промывали

27.-ным раствором хлористого калия с последующим высушиванием при той . же температуре. Далее опытную полоску погружали в раствор аргинина на !

О мин и в эти же пробирки вносили по

2 мл рабочего раствора для определения моневины. Затем пробы ставили в кипящую водяную баню на 12 мин. В контрольные образцы аргинин вносили на 2-й минуте пребывания их в бане.

Затем пробы охлаждали и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-24 при длине волны 525 нм.

Активность фермента в крови, определенная предлагаемым способом, составила 55 ед/л. При компьютерной томографии головного мозга в правом полушарии, в проекции, преимуществен" но, лентикулярного ядра, определяется свежее кровоизлияние средних размеров (не более 20 смЭ) без признаков прорыва крови в желудочки и субарахноидальное пространство. Правый боковой желудочек частично сдавлен. Имеются симптомы умеренно выраженной деформации среднего мозга и развивающегося перифокального отека.

Пример 3. Больной Г., 58 лет, диагноз: ГЭ, АГ, атеросклероз.

С 17 лет отмечалось повышение АД.

В 1979 году ОНМК со слабостью в левых конечностях. С января 1985 г. сла" бость в ногах.

В неврологическом статусе: память снижена, гипомимичен, отмечается дизартрия. Некоторая сглаженность правой носогубной складки. Кончик языка уклоняется вправо ° Отмечается повьппение тонуса в левых конечностях.

Сухожильные рефлексы высокие с расширенной рефлексогенной зоной. Клонус стоп. Симптом Маринеску-Родовича справа. Вызывается кистевой рефлекс

Россолимо с 2 сторон, S)D. Симптом

Россолимо, симптом Бабинского слева и Пуссена справа. Брюшные рефлексы не вызываются. Походка паретическая, мелкими шажками с элементами атаксии. Координаторные пробы выполняет с незначительной интенцией.

Заключение психиатра: изменение личности по органическому типу (co"" судистого генеза).

14!3530

На серии компьютерных томограмм головного мозга отмечается диффузное симметричное снижение плотности в белом веществе семиовальных центров обоих полушарий, которое распространяется также на участки нервной ткани, расположенные вокруг тел боковых желудочков (томографические признаки дисциркуляторной энцефалопа- 10 тии). Наблюдаются умеренное и системное расширение желудочковой системы и заметное увеличение субарахноидального пространства лобных долей, что полностью соответствует клиническим 15 данным.

Активность аргиназы определяли предлагаемым способом, аналогично примерам 1 и 2. Активность мозговой формы фермента в первый день поступления 20 в клинику 177 ед/л. На фоне уменьшения очаговой неврологической симптоматики и улучшения общего состояния на 19-й день активность мозговой формы фермента не выявлялась. 25

Пример 4. Больной Ш., 44 лет,. диагноз: ГЭ, гипертоническая болезнь

I-II ст. и начальные явления атеросклероза.

В течение последних 15 лет перно- 3(1 дически повышается АД до 150-160/

/90.мм рт.ст. и 170-180/110 при кризах. В 1983 г, отмечал значительное снижение памяти в течение нескольких дней, которое прошло после лечения.

Два года тому назад вновь ухудшилась память, появились затруднение концентрации внимания, трудности в подборе слов, утомляемость, головная боль. Самочувствие ухудшилось за по- 40 следний год, когда головная, боль стала почти постоянной (чаще в затылочной области), появилось головокружение.

В неврологическом статусе: легкий 45 симптом Горнера справа, легкая сглаженность правой носогубкой складки, непостоянный симптом Маринеску-Родовича справа. При выполнении пальценосовой пробы отмечаются элементы интенционного тремора. Гипергидроз ладоней и.стоп, t

Заключение психолога: высшие корковые функции не нарушены. Некоторое снижение памяти и особенности поведения личности и установок.

На серии компьютерных томограмм получены изображения суб- и супратенториальных образований головного мозга.

Патологических изменений в веществе мозга не выявлено. Желудочковая система обычной формы и размеров, субарахноидальное пространство не изменено.

Исследование активности фермента проводили предлагаемым способом, В первый день поступления активность мозговой формы фермента составила

110 ед/л, и на 30-й день, когда на фоне лечения регрессировала очаговая неврологическая симптоматика, исчезли головные боли, головокружение, парез лицевого нерва справа, симптом

Маринеску-Родовича справа и интен ционный тремор при выполнении пальценосовой пробы, активность составила

44 ед/л, что свидетельствует об уменьшении активности процесса.

Таким образом, предлагаемый способ является высокочувствительным при определении активности патологического процесса, в частности энцефалопатии.

Полученные результаты показали, что мозговая форма фермента не присутствует в сыворотке крови здоровых людей, в то же время активность аргиназы выявлена в сыворотке крови больных с заболеваниями нервной системы, сопровождающимися провреждением нейронов, Предлагаемый способ обеспечивает снижение травматичности (используется сыворотка крови в объеме 0,05 мкл вместо спинномозговой жидкости), повышение точности, так как позволяет диагностировать умеренно выраженные формы дисциркуляторной энцефалопатии и некоторые формы нарушения мозгового кровообращения, а также упрощение за счет снижения количества стадий в методике и воэможности длительного сохранения образцов.

Формула изобретения

Способ определения активности аргиназы мозга в сыворотке крови путем отбора пробы, обработки ее раствором формальдегида, нанесения смеси на носитель, промывания раствором хлористого калия, добавления раствора аргинина и иикубации с последующим определением мочевины, о т л и ч а ю— шийся тем, что,с целью повышения точности и упрощения способа, при одновременной воэможности длительного

14l3530

Составитель Н. Гуляева

Редактор А. Огар Техред Л.Олийнык Корректор Л. Патай

Заказ 3777/47 Тирам 847 . . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Уагород, ул. Проектная, 4 сохранения образцов, в качестве носителя используют фильтровальную бумагу, на которую наносят сыворотку крови в объеме 20-50 мкл, затем высушивают при 40-б0 С, а инкубацню с раствором ергинина проводят в течение lO мин.