Рекомбинантная плазмидная днк pmg 16 для обнаружения микроплазменных заражений

 

Изобретение относится к генной Ешженерии и может быть использовано для анализа клеточных культур. Цель изобретения состоит в повышении чувствительности способа обнаружения микоплазменных инфекций. Рекомби - нантную плазмидную ДНК pMgl6, содержащую фрагмент рибосомного оперона генов рРНК Mycoplasma gallisepticum, используют в качестве универсального зонда для обнаружения любого микоплазменного заражения в клеточных культурах. Осадок, полученный после центрифугирования (10000 об/мин, 10 мин) 1 ил супернатана исследуемой культуры клеток, лизируют саркозилом (до 0,5Х), сорбируют на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизуют с ДНК pMglS, меченой 32Р, с последующей автораднографией на рентгеновской пленке. с €

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СО(.)ИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (1% (Н) (51) 5 С 12 N ) 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКР)ТИЙ (46) 07 ° 09. 90. Бюл. У 33 (21) 4)22451/3)-)3 (22) 24.09.86 (7I) Институт цитологии АН СССР (72) С.Н .Борхсениус, Н.А,Меркулова и О.А.Чернова (53) 575.224.2; 57.7.2/048/ (088.8) (56) I.Med.Sci» )984, ч.20. р. 778-780. (54 ) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК

РМО 16 ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ, МИКОПЛАЗМЕННЫХ ЗАРАЖЕНИЙ (57) Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для анализа клеточных культур. Цель изобретения состоит в повышении чувствительности способа обнаружения микоплазменных инфекций. Рекомби". нантную плазмидную ДНК pMg)6, содержащую фрагмент рибосомного оперона генов рРНК Mycoplasma gallisepticum, используют в качестве универсального зонда для обнаружения любого микоплазменного заражения в клеточных культурах. Осадок, полученный после центрифугирования ()0000 об/мин, 10 мнн) I мл супернатана исследуемой культуры клеток, лиэируют саркозилом (до 0,5%), сорбируют на нитроцеллюлоэный фильтр и гнбридизуют с ДНК pMg)6, меченой 32Р, с последующей авторадиографней на рентгеновской пленке.

1413960

Изобретение относится к генной инженерии. Может быть использовано при содержании банка клеточных линий, а также при производстве моноклональных антител с использованием гибридомной техники в иммунологии.

Цель изобретения состоит в повышении чувствительности способа обнаружения микоплазменных инфекций.

Пример 1. Плаэмиду pMg 16 получали следующим образом, Микоплазменные частицы биомассы штамма

1фсор1аsma gallisepticum осаждают центрифугированием 10000 об/мин

30 мин; промывают стандартным SSC вскрывают 67-ным ТХУ вЂ” Na с 0,01 М

ЭДТА — Na и 0,57 SDS рН 8. ДНК экстрагируют смесями: фенол — хлороформ (1:1 ) и хлороформ - изоамиловый спирт (24:1), переосаждают и промывают этанолом, обрабатывают РНКазой (50 мкг/мл) и протеинаэой — К (50 мкг/мл). О нативности препаратов I1HK судят по величине гиперхромного эффек re и по электрофоретической поднижности в 1%"ном агарозном геле. Гидролиэ ДНК рестриктаэой

EcoR V и лигирование с вектором.

pBR 322, линеариэованным по сайту

EcoR Ч, проводят по стандартным методикам. Процессы гидролиза и лигирования контролируют электрофоретически. Полученные препараты используют для трансформации реципиентного штамма Е,coli. После селекции на среде ЕБ с ампициллином и обратной селекции с тетрациклином идентифицируют плазмиду, несущую фрагмент рибосомного оперона рРНК, с помощью гибридизации с ДНК плазмиды рКК 3535, несущей рибосомный оперон ггп В Е.coli.

Плаэмиду pMg 16 получают в препаративных количествах и очищают в градиенте плотности 1а ll.

Пример 2, ДНК клеточньм культур выделяли стандартными методами, для этого собирают клетки MX u

Не La, и предполагаемых микоплаэм цеитрифугированием культуральной жидкости при 10000 об/мин 30 мин.

Оказалось, что плазмида рМ 16 не гибридиэуется с ДНК эукариот, не контаминированных микоплаэмами, что является необходимым условием ее применения.

Оказалось также, чтс с помощью

ДНК гибридизации с pMg .6 можно уло1О

50 вить нг ДНК микоплазмы, что соот5 ветстнует .10 инфекционных частиц.

Известно, что в I ил культуральной жидкости клеток, культивируемых 1п

vitro при микоплаэменной инфекции, 5 содержится 10 - 10 микоплазменньм частиц, т.е. для проверки кле" точных культур на наличие микоплазм достаточно взять 1 мл культуральной жидкости.

В качестне контроля используют клеточные культуры МХ и Не Ьа по

I мл каждой, центрифугируют

10000 об/мин 5 мин, полученный осадок растворяют в 10 мкл стерильной дистиллированной воды, перемеш:знают, добавляют 5%"ный раствор саркозила до конечной концен рации 0,57., перемешивают, добавляют 5 объемов денатурирующего буфера (l 5 M NaC1;

0,5 M NaOH)„ выдержан смесь 10 мин при комнатной температуре, добавляют

SSC до десятикратного и переносят всю смесь на нитроцеллюлоэный фильтр.

Фильтр последовательно промывают в десятикратном SSC, двукратном SSC, 70 этаноле, сушат 2 ч при 80 С под вакуумом и гибридиэуют с 500 нг ДНК

pMg l6 меченой в реакции них-трансляции 32 Р р! ТФ.

Удельная активность зонда состав" в ляет 0 имп/мкг. Гибридизацию проводят н течение 10 ч в шестикратном

SSC с 0,57. SDS при 60 С с последующей отмывкой фильтра в двукратном

SSC при 60 С в течение 3 ч (3 смены по I ч) и в 0,17 SDS при комнатной температуре на качалке, авторадиографией на рентгенонской пленке при

-70 С 12 ч.

Плаэмида pMg 16 высокоспецифична к генам рРНК микоплаэм, инфицирующих клеточные культуры, и может быть ус" пешно использована для обнаружения именно микоплазменных инфекций клеток, культивируемых in vitro с помощью ДНК"ДНК гибридизации.

При этом удается обнаружить 1%

ДНК микоплазм среди ДНК исследуемых клеток и не менее нг ДНК микоплазм в дот"гибридизации. Вся процедура определения составляет не более суток.

Формула изобретения

Рекомбинантная плазмидная ДНК

pMg l6 для обнаружения микоплаэмен"

3 14!3960 ных эараяений раэмерои 6,86 т.п.о., содерааи ая ,l плаэииднув ДНЕ вектора pBR 322 раэиерою 4,36 т.п.о.;

EcoR Ч фрагмент гена рРНК Йусор1ааав gallisepticum раэиерои

2,5 т,п.о, кодируМщего часть гена

l6S и 238 рРНЦ уникальные сайты рестрикции:

EcoR V, Hinl Ш EcoR ? RU Iy

Рэ I, PVU II. Bal Х, ача I, Gal I и Bam HI) генетические маркеры

СеС " устойчивость к тетрвциклину, amp. устойчивость к аипициллииу, цлаэиида некоиьвгативиа.

Составитель Т. Забойкина

Техред М.Ходанич

4 корректор В.Гнрняк

Редактор Л.Павлова

Заказ 3319 Тираа 493

ВНИИПИ Государственного коиитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ф-35, Рауаская наб., д, 4/5

Подписное

l Производственно-полиграфическое предприятие, г. Уагород, ул. Проектная, 4.