Способ получения белка,понижающего содержание холестерина в крови млекопитающих животных
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения белка, обладающего свойством понижать содержание холестерина в крови нпекопитакмцих животных микробиологическим путем. Для осуществления способа используют один из семи штаммов рода Streptococcus, которые вьюелены от здорового человека. Один из штаммов (FERM ВР-296- ВР-302) культивируют в питательной среде в аэробных условиях при перемешивании. Полученную биомассу отделяют, дезинтегрируют , лизируют путем последовательного воздействия температурой и протеолитичёским ферментом. Из лизата выделяют осадок, обрабатывают его РНК-азой и очищают диализом. Выход белка CRP при использовании штамма Streptococcus faecium FERM ВР-296 f97,3 мг, он содержит 17 амино-кислот. LDj-ф более 802 мг/кг массы при внутрибрюшинном введении мышам. 2 табл. О)
СОНИ СОВЕТСНИХ Ф
РЕОЪБЛИН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ПАТЕН ГУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3682599/30-13 (22) 27. 12.83 (31) 57-227395 (32) 28. 12 ° 82 (33) ХР (46) 07.09.88. Бюл. У 33 .(71) Кабусики Кайся Эдванс Каихацу
Кенкюдэе (ЮР) (72) Ясуо Каваи И Куцунага Язава (JP) (53) 615. 711. 16 (088. 8) (54) СПОСОБ- ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА ПОНИЖАЮ"
ЩЕГО СОДЕРЖАНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА В КРОВИ
ИЛЕКОПИТАМЩИХ ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения белка, обладающего свойством понижать содержание холестерина в крови млекопитающих животных иикро„SU...142 0 2 АЗ (51)4 С 12 P 21/00//(С 12 Р 21/00, С 12 R 1:46) биологическим путем. Для осуществления способа используют один из семи штаимов рода Streptococcus, которые выделены от здорового человека. Один
as штамиов (FERM BP-296- ВР-302) .культивируют в питательной среде в аэробных условиях при переиешиванин.
Полученную биомассу отделяют, дезинтегрируют, лизируют путеи последовательного воздействия температурой и протеолитическим фериентом. Иэ лизата выделяют осадок, обрабатывают его
РИК-азой и очищают диализом. Выход белка CRP при использовании штамма
Streptococcus faecium РЕНИ BP-296
197,3 мг, он содержит 17 амино-кис- Е лот. ЕЭ р более 802 мг/кг массы при внутрибрюшинном введении иыпам.
2 табл.
1423002
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения гипохолестеринемически активного белка (CRP).
Для осуществления способа используют один из семи штаммов, выделенных иэ экскрементов здорового человека.
Зарегистрированы в Научно-исследовательском институте ферментации (FRI) и переданы на хранение под номерами
FERN-BP: Streptococcus faecium ADV
1009 FERN ВР-29б, Streptococcus faecalis ADV 9001 FERN BP-297, Streptococcus avium ADV 2003 FERN BP-298, Streptococcus salivalius ADV 10001
FERN BP-299, Streptococcus durans
ADU 3001 FERN BP-ЗОО, Streptococcus
mitis ADV 7001 FERN ВР-301, Streptoсоссп9 egu1nus ADV 8001 FERN ВР-302ф
Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штаммов представлены в табл.
Способ осуществляют следующим об1 разом.
0,2
5Î
Выращивание одного из указанных микроорганизмов осуществляют извест-! ным методом. Например, биомасса мо-! жет быть получена путем стационарного культивирования в питательном бу ЗО льоне в анаэробных условиях и может быть собрана путем центрифугирования культуры бактерий.
Состав питательного бульона, г:
Триптиказа 10
Дрожжевой экстракт 5
Триптоза 3
K HPO 3
Кй РО, 3
Триаммонийцитрат 2
Твин 80 1
Глюкоза 20
Хлоргидрат
45 цистеина
Солевой раствор 5 мл
Дистиллированная вода До 1 л рН 7, стерилизация с нагревом при
121 С в течение 15 мин.
Солевой раствор содержит, r:
NgSO 7Н,O 11в5
FeSO 7Н,О 0,68
NnO 2Н О 2,4
Дистиллированная вода 10 мл
Приготовление белка CRP, Выделение микроорганизмов. Каждый иэ указанных микробных штаммов инокулируют в питательный бульон Новова,инкубируют без перемешивания при 37 С в течение
5-10 ч в аэробных условиях, подавая питательный бульон с определенной концентрацией жизнеспособных бактериальных клеток. Этот питательный бульон непрерывно центрифугируют со скоростью вращения центрифуги 12000 об/мин.
Собранные бактериальные клетки затем промывают в солевом растворе (0,85Х
NaC1) до трех раз.
Дезинтеграция бактериальных клеток.
Промытые клетки суспензируют в физиологическом солевом растворе и теро мически обрабатывают при 115 С в течение 10 мин. Промытые и суспензированные в физиологическом солевом растворе бактериальные клетки дезинтегрируют ультразвуком.
Удаление жира иэ клеток. Дезинтего рированную клеточную суспензию смешивают со смесью. хлороформ — метанол (2:1 об/об). Затем компоненты, экстрагируемые органическим растворителем, полностью удаляют путем центрифугирования при скорости вращения центрифуги 3000 об/мин в течение 10 мин и хло:роформныи слой удаляют.
Обработка протеолитическими ферментами (лизисом). Обезжиренные клетки обрабатывают протеолитическими ферментами, такими как проназа, трипсин и пепсин, Из числа указанных протеолитических ферментов проназа является наиболее подходящей для данной цели.
Очистка. В поверхностный слой центрифугирования протеолитической реакционной смеси вводят осадители, такие как трихлоруксусная кислота (ТХУ) илн сульфат аммония, для осаждения белковой фракции. Белковую фракцию затем обрабатывают соответствующей нуклеазой для удаления составляющих нуклеиновой кислоты, таких как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (PHK) в данной фракции. После такой ферментной обработки осуществляют повторный диалиэ.
Частично очищенную белковую фракцию подвергают гель-фильтрации и фракционированию сульфатом аммония, и в конечном итоге получают чистый препарат белка — белок CRP.
1423002
55
Физико-химические характеристики белка CRP.
Химическая природа и характеристики растворимости: белый порошок, очень хорошо растворим в воде, а также растворим в ацетоне. При смешивао нии раствора белка CRP с сульфатом о аммония или ТХУ на холоду (4 С) наблюдается соответственно мутность и вы- 0 падение осадка.
Молекулярная масса белка CRP
30000+7000, что установлено методом гель-фильтрации с использованием колонки Toyopearl НИ55 и 25 ммоль буферного раствора трис-НС1, содержащего 0,3 моль NaC1 (рН 7,5) °
Изоэлектрическая точка белка CRP измерена методом изозлектрического фокусирования с использованием 57.-ного полиакриламидного геля, содержащего амфолин (рН 3,5-10), с конечной концентрацией 27 при 4 С, при ста-. бильном напряжении 200 В в течение ,3 ч. Для электродных растворов катода 25 и анода используют растворы 0,02 моль
НзРО и 1 моль NaCl соответственно.
Используют образец в количестве
100 мкг, окрашивание осуществляют посредством красителя Кумасси Bril"
liant Blue-250. Изоэлектрическая точка составляет 7,9+0,2;
Состав аминокислоты. Образец (1мг) суспензируют в 1 мл соляной кислоты и вводят в ампулу, эамораживают в" смеси сухой лед — метанол, и вытесняют воэ- З5 дух газообразным азотом (N ) в вакууме. Такое вытеснение газа повторяют три раза, ампулу запаивают в вакууме. о
После гидролиза при 110 С в течение
24 ч в нагревательной системе хлоргидрат удаляют путем испарения во вращательном испарителе в вакууме, и образец растворяют в 200 мкл 1/50 НС1.
Затем 50 мкл этого образца анализируют в анализаторе аминокислоты.
Аминокислотный состав, мол.7.:
Глицин 25,23
Алании 10,98
Глутамин 10,34
Аспарагин 8,20
Лизин 6,39
Лейцин 5, 5Ъ
Валин 5,41
Иэолейцин 5,18
Треонин 4,23
Тирозин 4,19
Серии 3,46
Пролин 2,62
Аргинин 2,60
Фенилаланин 2,51
Метионин 1,56
Гистидин 1,30
Пистеин 0,16
Кривые электрофореза на диске.
Электрофоретический анализ белка CRP (25 мкг) с использованием диска осуществляют с использованием полиакриламидного геля (7Е полиакриламида) в буферном растворе (трис-глицине, рН
8,3) при 4 мА/гель в течение 2,5 ч.
Характерная для белка кривая с резким максимумом исследуемого образца получена на расстоянии 4,2+0,2 см от анода.
Физиологические характеристики.
Белок CRP обладает способностью понижать содержание холестерина в крови млекопитающих животных при вводе его через рот. Такая активность является устойчивой в пределах температуры от
-80 до +115 С и рН от 4,1 до 10,9 при хранении белка CRP.
Фармакологические активности белка CRP.
Фармакологические эффекты. Анти" атеросклеротическое лекарство, кото" рое состоит из белка CRP, может вызвать черезвычайно сильное понижение холестерина крови в организме млекопитающих животных. B связи с этим данное лекарство используется в качестве терапевтического или профилактического средства от заболеваний, непооредственно связанных с атеросклерозом, гиперлипидемией, гиперлипопротеинемией, ксантоматозом, холелитиазом, гипертонией, диабетами и другими болезнями.
Препарат, соответствующий изобре1 тению, может использоваться для млекопитающих животных, его вводят через .рОт, внутрибрюшинной или внутривенной инъекцией и другими способами.
Доза одного приема препарата составляет примерно 1 мкг — 1 r на 1 кг массы больного. Предпочтительно введение через рот примерно 0,1-1,00 мг на 1 кг массы. Может быть выбрана любая форма препарата: в виде раствора в физиологическом солевом растворе и в другом растворителе, в виде инъекционно вводимого препарата, в виде порошка, приготовленного путем лиофилизации и другими способами, в виде свечей, желудочных таблеток с покрытием, подъязычных таблеток, гра1423О02 кул, капсул и т.д., вместе с сООтнетствующими носителями (например, крахмалом, декстрнном), раэбавляющимп основаниями (например, карбанатом каль5 ция, лактоэой), раэбанителями (напри" мер, физиологическим соленым раствором у дистиллирОнаннОи ВОПОЙ) и T o д е
Острая токсичность. Ь0 0 белка ! CRP составляет более 802 мг/кг массы при внутрибрюшинной инъекции в организм жпней. Данный белок в основном является нетаксичным при вводе через рот.
П р и и е р. Приготовление и очист 15 ка белка CRP.
Бактерии 8 1aptococcUs faac3U1II
АОЧ 1009 (FERN ВР-296) инокулируют в
2 л питательного бульона Rogosa c конечной концентрацией 1 10 бактериальных клеток на 1 мл., Инокулированную питательную среду инкубируют при 37 С в течение 10 ч без перемешивания в аэробных условиях, н результате чего получают 10 бактериальных 25
1 клеток на 1 мл среды культивирования.
Бактериальные клетки собирают путем непрерывного центрифугиронания со скоростью вращения центрифуги
12000 об/мнн, прамынают фиэиологичес- о ким соленым раствором (0,85 NaC1) и суспензируют н том же растворе, по" лучая 100 мл клеточной суспензии концентрацией 2 10"/мл.
Суспензию бактериальных клеток под-,.
35 вергают термической обработке при
115 С в течение 10 мин и трехкратна обрабатывают смесью хлороформ " метанол (2:1 об./об.) для удаления жиров.
Обезжиренную бактериальную суспен- 4 зию центрифугируют са скоростью нращения центрифуги 3000 об/мин в течение
10 мин, и нижний слой, например хлороформный, удаляют. Водный слой используют в качестве исходного матерна-4, ла для последующих этапов очистки.
Исходный материал обрабатывают
20 мг проназы (протеазы типа XIV). в
100 мл фосфатного буфера (рН 7,8), содержащего- 0„0015 моль СаС1 при
47 С в течение 24 ч, и последующую обработку 10 мг проказы осуществляют при тех же условиях.
Продукт, обработанный проназой, разделяют на фракции пу"гем центрифугирования со скоростью вращения центрифуги 3000 об/мин в течение 10 мин.
Во всплывшую Фракцию добавляют 1/9
Объема ООЙ-ной (мас„об.) ТХУ, затеи
6 ее выдерживают при 4 С н течение 3 ч
IIpv перемешивании и центрифугируют со скоростью вращения центрифуги
3000 Об/мин в течение 10 мин, получая осажденную и всплывшую фракции.
В осажденную фракцию вводят такой же объем 10 .-ной ТХУ, и данную процедуру повторяют ° Полученный осажденный продукт промывают три раза этиловым эфиром для удаления ТХУ, растворяют и 50 мл дистиллированной воды, нейтрализуют 1 í. NaOH диалиэируют с целью полного удаления ТХУ и, наконец, центрифугируют, Получают 345 мг (на сухую массу) осажденной фракции.
В полученную осажденную фракцию (345 мг) вводят 5 мл (О, 1 моль) трисацетатного буфера (рН 8,0), 1 мп (О, 1 моль) ацетата магния и 0 06 мл дезоксирибануклеазы (2 мг/мп деэаксирибонуклеазы I) и инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Затем реакционную смесь диализируют с использованием дистиллированной воды в качестве растворителя целлюлозной трубки в течение трех дней, причем деализирующиеся вещества имеют молекулярную массу меньше 3500. Диализиронанную фракцию выпаринают досуха. Полученный продукт далее суспенэируют в 5 мл (0,05 моль) ацетатного буфера (рН 4,6), содержащего 440 мол.ед. рибонуклеазы Т» инкубируют при 37 С в течение 3 ч и ди- ализируют с использованием дистиллированной воды в качестве растворителя. Диализированная фракция обозначается как очищенная фракция I (молекулярная масса 20000, масса сухой массы 285 мг).
Очищенную фракцию I вновь обраба« тывают рибонуклеазой Т и диализируют с получением очищенной фракции II (масса на сухую массу 274 мг). Фракцию II подают в хроматографическую колонку Toyopearl HW55 в которой используется 25 ммоль трис-НС1 буфер (pH 7,5), содержащий 0,3 моль NaC1.
Норове, элюирОнанную после 67 мл объема элюирования, обрабатывают сульфатом аммония (насыщенность 55X), и очищенную фракцию III (масса сухой массы 205,5 мт) получают из поверхностнога слоя жидкого продукта фракционирования сульфатом аммония.
Поскольку Фракция III содержит следовые количества сахара, то ее треххратно обрабатывают 10Х-ной ТХУ и диализируют при тех же условиях.
1423002 в
Формула изобретения
Т а блица 1
Штамм
Характеристика
ADV AD V
1009 9001 (BP-296)(BÐ-297
ADV AD V AD V ADU ADV
2003 10001 3001 7001 8001
ВР-298 (BP-299) (BP- (BP-301) (ВР-302)
300
Сфероид
Форма клетки Окраска по Граму
Гемолиз
Рост при температуоС.
45
Термическая устойчивость при 60 С в течение 30 мин
Рост в питательной среде культивирования при рН 9,6
Ослабляющая способность метиленового синего
Разжижение желатина
Получают очищенный белок CRP (масса сухой массы 197,3 r) .
В табл. 2 показаны выход и колччества белка по методу Лоури PHK5 микробным методом, ДНК-методом с использованием дифениламина и сахаров с использованием фенола H Удельная активность, приведенная в табл. 2, показывает способность каждой фракции снижать холестерин у обычных крыс на единицу массы крысы. Белок CRP может быть выделен и очищен с использованием других указанных бактериальных штаммов. Использование изобретения позволя- 20 ет получать белок, обладающий способностью снижать содержание холестерина в крови млекопитающих животных. Способ получения белка, понижающего содержание холестерина в крови мле" копитающих животных, заключающийся в том, что штамм Streptococcus faecium FERM BP-296, Streptococcus faecalis РЕВИ BP-297, Streptococcus avium PERM BP-298, Streptococcus salivalius РЕКИ ВР-299, Streptococcus durans PERM BP-300, Streptococcus mitis РЕВИ BP-30 1 или streptococcus eguinus РЕКИ BP-302 культивируют в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим отделечием полученной биомассы, лизисом ее последовательно термической и ферментативной обработкой, отделением полученного осадка, обработкой его рибонуклеазой и очисткой целевого продукта ди" ализом. 142 ЗООг о Продолжение табл. 1 Харак те Рост в питательной среде, содержащей: NaC1 (6,5X) желчь (40X) Продуктивность амми ах а Гипролиз гиппуровой кислоты Рост в питательной среде, содержащей: ND ND теллурит ТТС ND лактоза глицерин арабиноза мелетитоза сорбит антигенная группа П р и м е ч а н и е. х, - 2,3,5"трифенилтетразолийхлорид. х — не дано (ND) . Получение кислоты из углеродного источника: глюкоза зскулин инулин Итами ADV 29 ADV AD V 10001 3001 ВР-299)(BP300 ADV 7001 (ВР-30 Ч 302) 1423002 Таблица 2 Фракция Выход Белок ДНК РНК Сахар Удельная активность 345 265,9 43,6 6,3, 14,3 9,1 Осадок Очищенная фракция 285 260, 1 11,3 1,2 12, 1 1 1, 1 274 258 3 3 6 0 8 11 2 11 8 205,5 202,6 Следы Следы 2,9 16,9 Белок CRP 197,3 197,3 -"" -"- Следы 17,6 Техред Л.Сердюкова Корректор В.Бутяга Редактор Н. Рогулич Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, 11осква, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5 Заказ 4877 Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4
