Способ получения пептидов

 

Изобретение касается производства синтетических пептидов, в частности получения соединений общей формулы Н.ТуГ-А1a-Asp-Alа-IIe-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-DAla-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- -Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Q, где Q NH,; или Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg- -Gly NH , которые могут быть использованы в медицине. Цель- - создание новых укороченных пептидов с низкой токсичностью, способных стимулировать выделение гормона роста. Их синтез ведут реакцией трет-бутилоксикарбонил-Gly с п-метилбензгидриламингидрохлоридной смолой с последующим удалением защитной группы и дальнейшим наращиванием пептидной цепи в соответствии с аминокислотной последовательностью , отвечающей указанной формуле. Затем от полученной пептидной смолы общей формулы X ,Tyr(Xj)- -А1а-Азр(Хз)-А1а-11е-РЬе-ТЬг(Х4)- -Asn(Xi)-Ser(X4)-Tyr(Xi)-Arg(X)- -Lys(X)-Val-Leu-DAla-Gln(Xs)-Leu- -Ser(X4)-Ala-Arg(X4)-Lys(X,)-Leu- -Leu-Gln(X5)-Asp(X3)-Ile-Met-Ser(X4)- -Arg(Xg)-Gln(Xj)-Gln(X5)-Gly-W, где W Xg или -Glu(Xj)-Ser(X)-Asn(Xj- -Gln(Xp-Glu(X5)-Arg(Xj)-Gly-Xg ; X, - тpeт-бyтилoкcикapбoнилj X - 2,6-дихлорбензил; Хз - бензиловый зфиpj X - бензил; X5 - ксантил; X,- толуолсульфоНИЛ; -, - дихлорбензилоксикарбонил; X g - остаток п-метилбензгидриламиногидрохлоридной смолы, отщепляют трет-бутилоксикарбонильную группу обработкой СН jCOOH в среде хлористого метилена. Далее проводят деблокирование и отщепление полимерной смолы с помощью обработки продукта HF в присутствии амизола. Новые пептиды по активности близки к человеческому гормональному вьщелительному фактору (1-44)NH, но более доступны, т.к. могут быть получены синтетическим путем. 1 табл. а «о сл с и 1С в5 4 СП СЛ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИН

0ПИОЛНИК ИЗОЬГКтьниЯ

Н llATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3750475/23-04 (86) PCT/US 83/01564 (03.10.83) (22) 01.06.84 (31) 432663 (32) 04.10.82 (33) US (46) 23.09.88. Бюл. У 35 (71) Дзе Салк Институт фор Биолоджикал Стадиз (US) (72) Жан Эдуард Фредерик Ривье (СН), Йоахим Шпис (QL) и Вили Уолкер. Вейл (US) (53) 547.964.407 (088.8) (56) Химия полипептидов. / Под ред.

П.Катсояниса. — M.: Мир, 1977, с.368. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается производства синтетических пептидов, в частности получения соединений общей формулы Н.Tyr-Ala-Asp-Аlа — Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-DAla-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu -Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Q, где

NH< или Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly Мну которые могут быть использованы в медицине. Цель. - создание новых укороченных пептидов с низкой токсичностью, способных стимулировать выделение гормона роста. Их синтез ведут реакцией трет-бутилоксикарбонил-Gly с и-метипбензгидриламин„,Я0„„1426455 А3 (51) С 07 К 7/10 // А 61 К 37/02 гидрохлоридной смолой с последующим удалением защитной группы и дальнейшим наращиванием пептидной цепи в соответствии с аминокислотной последовательностью, отвечающей указанной формуле. Затем от полученной пептидной смолы общей формулы Х,Tyr(X2)

-Ala-Asp (Х >) -Аl а-Il е — Ph e- Thr (Х )—

-Аэп(Х5) -Ser(X4)-Tyr(X g? -Arg(X6)— LÓç(Х )-Val-Leu-DAla-Сlп(Х )-Leu-Бег (Х+) -Ala-Arg (X<) -Lys (Х,) -Leu-Leu-G1n (X +) -Asp (X>) -Ï å-Met-Ser (X <)— — Arg(Х )-Gln(X<) — Сlп(Х5)-Gly-W, где

W = X) или -Glu(X>)-Ser(X )-Asn(X )—

-Сlп(Х )-Glu(X )-Arg(X ) — Gly X>, Х| — трет-бутилоксикарбонил, Х|—

2,6-дихлорбензил; Х з — бензиловый эфир; Х вЂ” бенэил; Х вЂ” ксантил; X— толуолсульфонил; Х, — дихлорбензилоксикарбонил; X — остаток п-метилбензгидриламиногидрохлоридной смолы, отщепляют трет-бутилоксикарбонильную группу обработкой СН С00Н в среде хлористого метилена. Далее проводят деблокирование и отщепление полимерной смолы с помощью обработки продукта HF в присутствии амизола. Новые пептиды по активности близки к человеческому гормональному выделительному фактору (1-44)NH<, но более до ступны, т.к. могут быть получены синтетическим путем. 1 табл.

1426455

Изобретение относится к способу получения пептидов — новьгх биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения — способ получения новых синтетических укороченных пептидов, малотоксичных соединений, обладающих способностью стимулировать выделение гормона роста. !О

Пример 1. Синтез пептида (D-Ала ) — человеческий панкреатический гормональный выделительный фактор (1-39)-NH, имеющего формулу

Н вЂ” Tyr-Ala-Asp-Alà-Ilе-Phe-Thr-Asn- 15 — Ser-Tyr-Arg-1.уs-Va1 — Leu-DA1a-Gln-Ser-Al a-Arg-1.ys-1.eu-Leu-1.еи-Г1п-Asp-Il e-Met-Ser-Arg-Gln-Сlп-Гlу-Glu-Ser-Asn-G1п-Glu-АгВ-G1у — NH< осуществляют ступенчатым образом, ис- 20 пользуя пептидный синтезатор Бекман 990, на параметилбензгидриламингидрохлоридной смоле, такой, какую поставляет фирма Bachem. Inc.,имеющей пределы замещения примерно 0 1— 25

0,5 млмоль/г смолы. Связывание трет-бутилоксикарбонил-Gly с 2 r смолы осуществляют общим способом, в схемах А и В, которые используют во всем синтезе, и это дает замещение примерно 0,35 млмоль Gly на грамм смолы. Все используемые растворители тщательно обезгаживают путем продувки инертным газом, например гелием или азотом, чтобы гарантировать отсутствие кислорода, который может нежелательно окислить серу остатка

Met.

Реагент

Время смешивания, мин 50

607 трифторуксусной кислоты / 27 этанди10 тиола

607. трифторуксусной кислоты / 2.. этанди55 тиола

Изопентанол / 17, этан0,5 дитиола

После снятия защиты и нейтрализа- 40 ции пептидную цепь выстраивают ступенька за ступенькой на смоле. Снятие защиты, нейтр глизацию и добавление каждой аминокислоты осуществляют в соответствии со способом по схемам 45

АиВ.

Снятие защиты предпочтительно осуществлять согласно схеме А.

Тризтиламин (107.) в

СН С1

МеОН

Триэтиламин (107) в СН <.1 г

МеОН (дв ажды)

СН Сl (дважды)

Связывание предпочтительно ствлять согласно схеме В:

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5 осущеРеагент

Время смешивания мин

N,N -Дициклогексилкарбодиимид

Трет-бутилоксикарбонил-аминокислота

Ne0H (дважды)

СН С1 (дважды)

СагО (3 моль/л) в

СНЗС12

СН,С1, МеОН

СЬ С1 (дважды) 50-90

0,5

0,5

15,0

0 5

0,5

0,5

От одного до двух млмолей аминокислоты, защищенной трет-бутилоксикарбонидом, в хлористом метилене используют на грамм смолы в сочетании с одним эквивалентом 1,0 молярного

N,N -дициклогексилкарбодиимида в хло-! ристом метилене в течение двух часов.

При связывании трет-бутилоксикарбонил-Arg (толуолсульфонил) используют смесь 507. диметилформамида и хлористого метилена..Бензиловый эфир используют в качестве гидроксильной защитной группы боковой цепи для Ser u

Thr. Паранитрофениловый сложный эфир используют для активации карбоксильного конца Asn или Гlп, и, например, трет-бутилоксикарбонил-Asn (пара-нитрофениловый эфир) связывают в течение ночи, используя один эквивалент бутилового спирта в 507.-ной смеси диметилформамида и хлористого метилена, причем в этом случае добавляют дициклогексилкарбонид. Аминогруппу Азп или С1гг защищают ксантилом, если вместо способа активного эфира используют дициклогексилкарбонильное связывание. Дихлорбензилоксикарбонил используют в качестве защитной группы для боковой цепи Lys.

Толуолсульфонил используют для защиты гуандиновой группы Arg, а карбоксильную группу Gly или Asp защищают бензилом. Фенольную гидроксильную группу Tgr защищают 2,6-дихлорбензилом. В конце синтеза получают пептид

3 142 следующего состава Х,-Tyr(X >)-Л1а-Asp(Х )-Ala-l1e-Р11е-Thг(Х„) — Asp(Х>)— — Sеr(Х+) -Туг(Хq) — Arg (Х<) -1-ys (X ч)

-Va1-1.еи-DA1a-G1u (Х» ) -Leu-Ser (Х 4)—

-Ala-Arg (Х 6) -Lys (Х,) -1.eu-Leu-С1п (Х )—

Аяр (Х ) -Il å-Ме t- Se r (Х ) -Arg (Х, )—

С1п(Х )-С1п(Х )-Сlу-С1и(Х ) — Ser(Xy) — Asn(X )-Gln(X )-Gly(X )-Arg(X<)—

-С1у(Х,), где Х, — трет-бутилоксикарбонил, Х вЂ”

2,6-дихлорбензил, X> — бензиловый эфир, Х вЂ” бенэил, Х вЂ” ксантил, Х вЂ” толуолсульфонил, X, — дихлорбензилоксикарбонил, Х вЂ” NH-смоляной носитель. Ксантил может быть частично или полностью удален обработкой трифторуксусной кислотой, используемой для удаления e -аминозащитной группы.

После связывания со смолой последнего остатка Tyr трет-бутилоксикарбонил удаляют 607. †н трифторуксусной кислотой в СН С1 и получают

3,4 г защищенной пептидной смолы. Для отщипления защитных групп. с остального защищенного пептида-смолы, его обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода на грамм пептида-смолы при — 20 С в течение получаса и при 0 С в течение получаса. После удаления

/ фтористого водорода под высоким вакуумом остаток смолы-пептида промывают попеременно сухим диэтиловым эфиром и хлороформом, а затем пептид экстрагируют обезгаженным 2 н.водным раствором уксусной кислоты и отделяют от смолы фильтрованием.

Отщепленный и лишенный защиты пептид затем растворяют в 0,57-ной уксусной кислоте и подвергают его очистке, которая может включать тонкую гель-фильтрацию на Сефадексе

G-50. Получают около 1,62 r пептида, Затем пептид подвергают дальнейшей очистке с помощью препаративной или полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией. Кассетную установку Mater Associates

prep. h. С-500 заполняют на 17 микрон

С кремнезом, поставляемым фирмой

Vudas 300А. Градиент ОН СИ в TEAP создают с помощью градиентного маркера низкого давления Eldex.- Хроматографические фракции тщательно отбирают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и собирают только фракции, обладающие значительной чистотой. Обессоливание очищенных

6455

35

50

30 фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществляют с помощью градиента СН>CN в О, 17-ной трифторуксусной кислоте. Центральный срез затем лиофилизируют, получают 107 млг целевого пептида, чистота которого OKOло 1001. Величина оптического вращения чистого пептида (al D = -56,3

Пример 2. Синтез пептида

fD-Ала " 1- человеческий панкреатический гормональный вьщелительный фактор (1-32)-NHg, имеющего формулу

Н-Tyr-А1а-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser=,Tór-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala-G1n-Leu-Sег-Аlà-Arg-Lys-Leu-Leu-Leu-G1ï-Asр-Пе-Меt — Ser-Arg-Gln-41y-NH<9 осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бек" ман 990, на параметилбенэгидриламиновой смоле по примеру 1. Получают ,96,5Z пептида 96,57-ной чистоты при использовании тонкостенной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Величина оптического вращения составляет fd1 D =

= -57,9

Пример 3. Синтез фрагмента человеческого панкреатического гормонального вьделительного фактора, т.е. человеческого панкреатического гормонального выделительного фактора (132)-NH формулы

Н- Ty r-A l а — As p-Al à- I l e-Ph e- Th r-As n-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Пе-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH>, осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бекман 990, на параметилбензгидриламиновой смоле по примеру 1. Этот аналог признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пример 4. Синтез фрагмента человеческого панкреатического гормонального вьделительного фактора, т.е. человеческого панкреатического гормонального вьделительного фактора (139)-NH имеющего формулу

Н-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Glu-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Glu-GIu-Gly-Glu-Ser-Авп-Gln-Gly-Arg-G1y-ИН,, 26455

5 14 осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бекман 990, на параметилбензгидриламиновой смоле по примеру 1. Пептид признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пример 5. Синтез пептида

t D-Ала ) — человеческий панкреатический гормональный выделительный фактор (1-39)-NH, имеющего формулу

Н-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ale-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-G1n- . — Sep — Пе — Меt-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-G1y-Arg-Gly-NH<, осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бек) ман 990, на параметилбензгидриламиновой смоле по примеру 1. Пептид признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проведены биологические испытания полученных соединений.

Для определения эффективности различных синтетических пептидов при

I стимуляции выделения гормона 1 оста ! проводят анализы in vitro, используя в качестве стандарта синтетический человеческий панкреатический гормональный выделительный фактор (hpGRF(1-4О)ОН, поскольку он является эквивалентом нативного пептида) при параллельном сравнении с эквимолярными концентрациями природного

hpGRF(1-44)МН - и различных других синтезированных аналогов.

Используют культуры, которые включают клетки гипофиза крысы, удаленного за четыре или пять дней до этоКультуры, которые считаются оптимальными для выделения гормона роста, используют для сравнительного испытания. Инкубирование испытываемого вещества осуществляют в течение 3-4 ч, после чего берут аликвоты культуральной среды и обрабатывают, чтобы измерить содержание в них иммунореакционного гормона роста хорошо известным способом, радиоиммуноанализа.

Результаты сравнительных испытаний в виде протокола приведены в таблице.

В таблице дан уровень гормона роста в образцах клеточных культур методом радиоиммунного анализа.

При проведении испытаний используют клетки типа РАР/GRF, Культурная среда: 27. FCS + 5 nfl DEX(p — PI) + Среда инкубирования: 0,17 бис-(триметил5 силил)-ацетамид аскорбиновая кислота/НБМе;(термин FCS означает эмбриональную телячью сыворотку; DEX— дексаметазон, термин PAP означает крысиную переднюю долю гипофиза и показывает, что при испытании использовали первичные кулвтуры клеток передней доли гипофиза крысы) °

Испытания in vitro этих синтетических пептидов показывают, что эффективная концентрация, дающая 507ный эффект (EC„), изменяется от 20 до !ОО-пикомолярной, а самая низкая эФфективная концентрация составляет

3-8 пмоль в литре. Максимальная эф, фективная концентрация для человечес— кого панкреатического гормонального выделительного фактора была примерно

1-наномолярной.

Кроме испытании хп vitro íà ñåêрецию гормона роста, проводили также эксперименты in vivo путем введения синтетического пептида через вживленный катетер в свободно бегающих нормальных самцов крыс. Животных предварительно обрабатывают FL А-63, ингибитором допаминовой гидроксилазы, который подавляет спонтанную секрецию гормона роста, не влияя на реакцию к экзогенному гормональному выде лительному фактору. Образцы крови берут через этот же катетер непосредственно перед инъекцией и через 5 и

20 мин после нее, уровни гормона роста в крови измеряют с помощью радиоиммуноаналиэа. Результаты показывают, I что синтетические пептиды, полученные предлагаемым способом, являются мощными стимуляторами секреции питуитарного гормона роста и сравнимы по активности с природными гормональными выделительными факторами.

Таким образом, проведенные испытания показали, что соединения, полученные предлагаемым способом, являются малотоксичными биологически активными соединениями, способствующими секреции гормона роста, по активности они близки человеческому гормональному выделительному фактору (1-44)NH, но доступнее его, поскольку содержат в своей цепи меньшее число аминокислотных остатков (32 и 39) 1426455 и могут быть получены синтетическим путем.

Ф о р м ул а и з о б р е т е н и я

Способ получения пептидов общей формулы I

Н-Туг-Лl а-Asp-Al a-Il å-Phe-Thr-Asn-Ser-Туг-Arg-Lys-Val-Leu-DAla †Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-1.уs-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-С1п-Gln-Gly-Q, ! где Q — NH или Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Агg†- Glу-NH отличающийся тем, что трет-бутилоксикарбонил-Gly вводят во взаимодействие с параметилбенэгидриламингидрохлоридной смолой, уда-; ляют защитную группу и затем проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с аминокислотной последовательностью, отвечающей соединению общей формулы I„ и от.полученной пептидной смолы общей формулы II

15

25

Среднее Конц/доза значение

Пептид

Показания счетчика

0,81

1,17

1,3

1,09

Контроль

2,02

1,55

1,90

2,15

3,57 50Л

3,54

3,58

3 65

0,02

102-34-!5

7,60

7,74

6,34

7,22

10)l 10 пМ

503

О,1

11,99

8,87

10,00

11,19

10,07

10, 13

12, 03

10,61

8,77

0,5

10Л 250 пМ 25

9,41

9,29

50 А

9,83

9,98

12,5

1,87

2,20

2,71

4,26

7,85

son

4,30

4,59

4,05

0,02

1 02-56-1 5

О, 9084 (0,474-1,73)

1, 003

3,48

8,93

10Л 10 пМ

50Л

6,75

0,1

8,99

10,94

12, 09

9,43

8,35

0,5

11,24

1 О, 36

11,28

10 А 250 пМ 25

Образцы клеточных культур г J з

Х Туг(Х )-Ala-Asp(X>) Лlа-Ile-Phe-T? г(Х )-Asn(X>)-Ser(X<)-Туг(Х )-Агя (Х< ) -1 уз (Х ) -Va 1 -L eu- DAl a-G 1 n (X )-Leu-Ser(X )-Аlа-Arg(X )-Lys(X )-Leu-Leu — Gln(X )-Азр(Хэ)-Ile-Met-Ser(X<)-Aig(X )-Gln(X<) Сlп(Х )-Gly-W, где W — X> или -Glu(Xq)-Ser(X<)—

-Asn(X>) -Сlп(Х )-Glu (Х P-Arg(Xc)-Gly Х, Х, — трет- бутилоксилкарбонил;

Х - 2,6-дихлорбензил;

Х - бенэиловый эфир, Х - бенэил, Х вЂ” ксантип, Х -толуолсульфонил, Х, — дихлорбензилоксикарбонил, Х - остаток параметилбенэгидриламингилрохлоридной смолы; отщепляют трет-бутилоксикарбонильную группу обработкой трифторуксусной кислотой в хлористом метилене и затем проводят деблокирование и отщепление полимерной смолы обработкой полученного продукта фтористым водородом в присутствии анизола.

1ОЛ 0,4 пМ 0,004 hpGRF(1 — 40)OH

10Л 0,4 пМ 0,004 hpGRF(1-44)NH<,0

1426455 (Продолжение таблицы

Образцы клетОчных культур Среднее Конц/доза

Пептид значение (2 ) Показания счетчика (0,664-1,02) 11, 63 .1, 69

9,39

10,67

10, 00

50,1

t DAIa 3hpGRF(1-32) NH

1,43

1,61

10Л

1,58

2,77

2,57

2,71

2,68

102-70-15

50Л

6,38 10Л 10 пИ 0,1

6,74

6,80

0,4257 (О, 2 75-0, 658) 5,55

8,17 50Л

8,05

8,17

8,29

11, 01

9,68

10,11

10Л

9,43

9,97

9,75

9,72

50 2) 4,22

5Л 2пМ 001

3,27

3,95

0,1

t 6,93

13, 09

5,28

50Л

7,81

5il 200 пМ 1

12,23

13,21

13,61

12,86

50л

13,55

Составитель В.Волкова

Редактор В.Бугренкова Техред M,Äèäûê Корректор И.Муски

Тираж 348

Подписное

Заказ 5846

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4

4,37

5,28

13,84

14,18

12,5

04 пМ 0004

О, 02

0,5

250 пИ 2,5

12,5

t DAI à )hpGRF(1 — 39) NH

1 02-40- 1 5 (О, 067-0, 268)