Штамм культивируемых клеток почки мини-свиньи,используемый в качестве тест-системы для репродукции и изучения вируса гриппа

 

Изобретение относится к вирусологии , в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов. Целью изобретения является получение перевиваемой линии клеток лабораторной мини-свиньи, свободной от контаминантбв,обеспечивающей репродукцию вируса гриппа и служащей сингенной системой при экспериментальных исследованиях. Линия клеток ПСМ получена из почки двухнедельного мини-поросенка пассированием на среде Игла MEM, содержащей 10% сьшоротки крупного рогатого скота После 60-го пассажа карйотип стабилизируется , модельный класс составляют клетки с 60 хромосомами. Клетки линии ПСМ чувствительны к различным штаммам вируса гриппа. Штамм хранится в коллекции перевиваемых культур ВНИИ молекулярной экспериментальной ветеринарии под № 20. 1 табл. (О (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (111

А1 (50 4С 12 N 5 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО.ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4089194/28-13 (22) 11.07.86 (46) 15,10.88. Бюл. У 38 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) А,А. Царева, А.А. Исаенко, l0.À. Юрченко, С.И. Машукова и Е.В. Дмитриева (53) 578.085. 23(088.8) (56) Тихонов В.Н,, Панарина Л,М.

Некоторые генетические особенности первых отечественных мини-свиней минисибс. — Генетика, 1981, т. 17, 11 5, с. 883-895.

Куликова К.С. и др. Тезисы докладов на 2-й научной конференции

МНИИВП, М.: 1960, с.57.

1 (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ .

МИНИ-СВИНЬИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ

ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ И ИЗУЧЕ. НИЯ ВИРУСА ГРИППА (57) Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов. Целью изобретения является получение перевиваемой линии клеток лабораторной мини-свиньи, 1 свободной от контаминантов, обеспечивающей репродукцию вируса гриппа и служащей сингенной системой при экспериментальных исследованиях. Линия клеток ПСМ получена из почки двухнедельного мини-поросенка пассированием на среде Игла МЕМ, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота °

После 60-го пассажа кариотип стабилизируется, модельный класс составляют клетки с 60 хромосомами. Клетки линии IICM чувствительны к различным штаммам вируса гриппа. Штамм хранится в коллекции перевиваемых культур

ВНИИ молекулярной экспериментальной ветеринарии под У 20. 1 табл.!

430403

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов.

Цель изобретения — получение оте5 ! чественной стабильной перевиваемой линии клеток лабораторной мини-сниньи свободной от контаминантов, культивируемой на доступных питательных средах, обеспечивающей репродукцию вируса гриппа и служащей сингенной системой при экспериментальных.исследованиях, проводимых с использованием мини-свиней. 15

Линия перевиваемых клеток почки мини-сниньи ПСМ депон.1рована в Коллекции перениваемых соматических клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Всесоюзь, го НИИ 20 экспериментальной ветеринарии

ВАСХНИЛ, штамму присвоен коллекционный У 20.

Линию клеток ПСМ получают следующим образом. 25

В качестве исходной ткани используют почку двухнедельного мини-поросенка.Почку извлекают с соблюдением правил антисептики,помещают в стерильную чашку Петри с раствором Эрла, 30 содержащим антибиотики — пенициллин (калиевая соль) и стрептомицин по

1000 мкг/мл, стараясь не повредить почечную артерию и вену. Изолированную почку переносят н чашку Петри, не повреждая капсулы отпрепарируют от жирового сальника. В артерию через эатупленную иглу нагнетают раствор

Хенкса, содержащий 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептамицина 40 для промывания органа. Затем поЧку промывают 0,25Х-ным растнором трипсио на при 37 С в течение 30 мин да появления под капсулой сети трещин. Почку переносят в чистую чашку Петри, оснобождают от капсулы, отделяют корконый слой, механически измельчают и дезагрегируют в питательной среде на магнитной мешалке. Клеточную суспенэию без предварительного центрифу50 гиронания фильтруют через 8-слойную марлевую салфетку, разбавляют до концентрации 400 тыс. кл. в 1 мл средой

Игла МЕМ, содержащей 10Х сыворотки крупного рогатого скота, предварительно обработанной полиэтиленгликолем (м.в. 6000) 0,6 г/л глютамина, 100 мкг/мл канамицина, высевают в чашки Карреля и помещают в термастат о при 32 С для предотвращения разрастания фибробластов. Каждые 3-4 сут ° проводят частичное на 1/5-!/3 обновление среды. Первый пересев делают через 10, второй через 8, третий через 6 сут. Ввиду увеличения скорости роста к пятому пассажу клетки пересевают через 3-4 сут. Коэффициент рассева I/3. В дальнейшем клетки культивируют в монослое с применением среды Игла МЕМ,содержащей I OX сыворотки крупного рогатого скота,нативной или обработанной полиэтиленгликолем.Клетки снимают со стекла смесью 0,023-ного версена (1/2-2/3) и 0,257-ного раствора трипсина (I/2-1/3) беэ центрифугирования, дважды обмыв моно0 слой прогретой до 36,5 C смесью и проинкубировав в течение 5-10 мин.

Далее клетки ресуспендируют в свежей среде и рассевают в сосуды для культивирования с концентрацией

100 тыс. кл. в I мл. Пересевы осуществляют через 3-5 сут с кратностью рассева 1:4-1:5.

Полученная линия перевинаемых клеток ПСМ имеет следующие морфологические признаки, Культура представлена эпителиоподабными клетками с округлыми и овальными ядрами, имеющими от 1 до 4 ядрышек. Цитоплазма мелкозернистая, слабо накуолизированная. Границы клеток в монослое четко различимы.

По данным электроннамикроскопического анализа, изучение в люминесцентном микроскопе препаратов, окрашенных ДНК-флюорохромами, высева на селективных средах, гемадсорбцией с эритроцитами морской свинки, клетки свободны от вирусной, микаплаэменной, грибканой и бактериальной контаминации.

Модельный класс составляют клетки с 60 хромосомами. Анализ кариотипа с помощью G-метода дифференциального акрашивания показал, что кариотип клеток в линии является н основном трисомным, Произошло слияние 15 и 17 (15 > 17) хромосом 9 и 17 (9:17), выявляется хромосома, являющаяся результатом слияния двух гомологов 18 хромосомы i (18)., Хромосома t (9; 17) может считаться маркерной для клеток линии ПСМ . При окрашивании азотнокислым серебром выявлено, что числа хромосом, несущих

ЯО районы, варьирует от до 4.

1430403

Клетки линии ПСМ чувствительны ! к различным штаммам вируса гриппа.

Уровень накопления вирусов определяют на третьи сутки после заражения клеток линии ПСМ путем титрования на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) по ЭИД д /мл.

Линия перевиваемых клеток IICM может быть использована в вирусолоГнческих исследованиях для репродукции и изучения вируса гриппа, а также как сингенная система при экспериментальных исследованиях с лабораторными мини-свиньями.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток почки мини-свиньи ВСКК (СХЖ) В 20, используемый в качестве тест-системы для репродукции н изучения вируса гриппа.

Культура клеток

Штаммы вируса гриппа

А/Aichi/2/68 А/Bangkok А/Ленинград

HH3N2 2/79 385/80

H3N2

А/Weybridge

H7N7

4,25

4,5

5,0

4,75

ПСМ

5,25

4,0

5,0

СПЭВ

Кожномышечные клетки эмбриона человека

3,75

3,75

3,5

2,75 Составитель И. Тареева

Редактор Н. Киштулинец Техред А. Кравчук

I»

Корректор С. Шекмар

Заказ 5302/23 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4

Клетки линии ПСМ хранят в замороженном состоянии в жидком азоте при о — 196 С. Режим замораживания: снятые со стекла смесью версена и трип5 сина и ресуспендированные в свежей среде клетки центрифугируют и ресуспендируют в новой порции ростовой среды, содержащей 10Х сыворотки КРС до концентрации 3,3-6,5 млн.кл в 1 мл.1р

Затем медленно, при постоянном перемешивании добавляют глицерин до конечной концентрации 10Х от общего объема. Суспензию клеток разливают по ампулам и эамораживают в смеси спир- 15 та и жидкого азота при понижении темо о пературы на 1 С в 1 мин до -40 С с последующим погружением в хранилище биопродуктов.

Режим восстановления. Ампулы с 20 клетками после извлечения иэ жидкого азота помещают в водяную баню с о температурой 38 С. Суспенэию размороженных клеток переносят в колбу и порциями, постоянно перемешивая, с ин- 25 тервалом в 1-2 мин добавляют ростовую среду: 0,5; 0,5; 1 2 2 и 3 мл, затем суспензию центрифугируют и ресуспендируют в свежей ростовой среде, подсчитывают общее количество клеток 30 и процент жизнеспособных и разводят ростовой средой до концентрации жизнеспособных клеток 100 тыс. кл/мл.

В таблице даны результаты репродукции различных штаммов вируса гриппа на перевиваемых культурах клеток.

° Из данных таблицы следует, что клетки линии ПСМ обладают примерно одинаковой чувствительностью к вирусу гриппа в сравнении с клетками линии СПЭВ и значительно превосходят линию кожно-мышечных клеток эмбриона человека.