Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus ,используемый для получения моноклональных антител к са @ - атфазе саркоплазматического ретикулума сердца собаки
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для кардиологических исследований. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ), реагирующие с Са -АТфазой из сердца и скелетных мьппц животных и человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных кальций-оксалатным препаратом саркоплазматического ретикулума сердечной мышцы собаки, с клетками миеломы P3-Ag 8«653. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с 10% донорской телячьей сыворотки при 37°С в атмосфере 5% СО, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Секреция МОнАТ на 3-4 день культивирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 5 мг/мл асци- . . тической жидкости. МонАТ относятся к классу Ig М, они специфически взаимодействуют с Са - АТфазой из сердца и скелетных мьшц животных и человека. МонАТ могут быть использованы для диагностики патологий миокарда и сердечно- . сосудистой системы, 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУ БЛИН
14870 А1 (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbITVM (21) 4220302/28-13 (22) 30.03.87 (46) 07.08.88. Бюл. К 29 (7 1) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР (72) В.В.Черепахин, С.И.Сырбу, О.В.Рохлин, Д.О.Левицкий, В.А.Логинов и М.И.Попович (53) 578.085.23(088.8) (56) Zubrzycka — Gaarm Е. МС Do-nald G Phillips L. et al.
I. Bioenerg. Biomembr., 1984, v. 16, р. 44 1-463. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NJS MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К Са -АТфазе САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА СЕРДЦА
СОБАКИ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для кардиологических исследований.
Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых кле(51)4 С 12 N 5/00 А 61 К 39 3 5 ток животных Mus musculus продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ), реагирующие с Са + -АТфазой из сердца и скелетных мышц животных и человека. Штамм получают гибриди-. зацией спленоцитов мьппей линии
BALB/ñ, иммунизированных кальций"оксалатным препаратом саркоплазматического ретикулума сердечной мышцы собаки, с клетками миеломы P3-AS
8i653. Клетки культивируют в среде
RPMI-1640 с 10Х донорской телячьей сыворотки при 3? С в атмосфере 5Х
СО, клетки пассируют один раз в
3-4 дня, кратность рассева 1:10.
Секреция МОнАТ на 3-4 день культи- a вирования составляет 15-20 мкг/мп культуральной среды и 5 мг/мл асцитической жидкости. МонАТ относятся к классу Ig М, они специфически взаимодействуют с Са2+ — АТфазой из сердца и скелетных мышц животных и человека.
МонАТ могут быть использованы для пиагностики патологий миокарда н сердечно- . сосудистой системы. 2 табл.
М 4
1414870
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано кардиологических исследованиях.
Цель изобретения — получение
Штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ), взаимодействующие с Са2—
АТфазой саркоплазматического ретику ума (СР) сердца и скелетных мьппц животных и человека.
Штамм получают следующим образом.
Мьппей линии BALB/с иммунизируют внутрибрюшинно кальций-оскалатным 15
1 репаратом CP из сердечной мьппцы собаки. Первую иммунизацию проводят
1 00 мкг антигена в полном адьюванте ейнда. Повторно антиген в дозе
5Р мкг в буфере ФСБ (О, 15 М NaC1, 20
0,005 М Na-фосфатный буфер, рН .7,46) в одят внутрибрюшинно через 7 дн, а затем через 14, 15, 16 и 17 дн. етки селезенки используют для гибридизации на 18-й день. 25
Клетки миеломы линии РЗ-Ag8 653 р астят на среде kPMI 1640, содержащЬй 2 мМ L-глутамина, 100 мкг канамиц яна в 1 мл, 0,05Х меркаптоэтанола, а: ; также 10Х донорской или эмбрио- 30 н льной телячьей сыворотки, Клетки культивируют при 37 С в СО -инкубаторе. Слияние клеток селезенки иммунизированных мьппей с клетками шеломы проводят с использованием полиэтиленгликоля с мол.м. 2000.
Суспензию спленоцитов получают из селезенок в стеклянном гомогенизаторе и промывают в бессывороточной среде Игла. Затем суспензию клеток 40 центрифугируют в перколле (плотность
1,069) и для слияния используют клетки, осаждаемые в течение 20 мин при скорости 2000 об/мин, 50 млн спленоцитов смешивают с 10 млн миеломных клеток ч центрифугируют в течение
10 мин при 900 об/мин. Смесь клеток о помещают в термостат при 37 С на
20 мин. Надосадочную жидкость сливают, к клеткам в течение 2 мин добавляют 0,6 мл теплого 40Х-ного раствора полиэтиленгликоля на среде RPMI с 15Х диметилсульфоксида. Клетки после слияния отмывают средой kPMI, суспендируют в селективной среде
ГАТ, содержащей О, 1 мМ гипоксантина, f6 мкМ тимидина, 0,4 мкМ аминоптерина и 0,3 мкМ глицина. Клетки рассевают в 96-лурочные плоскодонные пластинки из расчета 50000 клеток на одну лунку, Гибридомные популяции, секретнрующие в культуральную среду антитела к мембранам СР сердечной мышцы собаки, клонируют далее методом конечных разведений. В качестве питающего слоя используют
1 перитонеальные клетки мышей линии г
BALB/с. Полученный штамм обозначает
1ЕЗ, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером
ВСКК(П) 960 и характеризуется следующими признаками.
Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования — сердца
RPMI-1640 с 10% донорской телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина
100 мкг/мл канамицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5Х
СО
Для выращивания штамма используют пластиковую посуду; посевная доза
100 тыс. клеток на 1 мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная.
Культивирование в организме животных. Для выращивания асцита пригодны мыши ВАЯВ/с. Мьппам эа 7:-15 дн до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана.
Клетки инъецируют внутрибрюшинно по
1-Зх10 клеток в 1 мл среды Игла.
Асцит формируется через 12-14 дней.
Продуктивность штамма. Секреция
СонАТ на 3-4-й день культивирования составляет 15-20 мкг в 1 мл культу- ральной среды и 5 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении методом торможения радиоиммуноадсорбции.
Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует ИонАТ, относящиеся к 1g M классу. Метод оценки специфичности: тест на связывание
МонАТ с иммобилиэованными мембранами СР или с очищенной Са -АТфазой (радиоиммунный анализ). Антитела не оказывают ингибнрующего действия на активность Са -АТфаэы.
Стабильность продукции. Продукция МонАТ сохраняется как минимум до 20 пассажей in vitro и до трех пассажей в асцитной форме.
Криокоисервирование.Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 1ОХ диметнл1414870
Связьвание меченых
Первые антитела, Антиген вторых антител, имп/мин
Разведение
Шифр
6300
1:1О
5900
То же
4400
1: 100
1: 1000
1600
Бычий сывороточный альбумин (контроль) 450
400
Штамм ROP (контрольный
1g М) Са-АТфаза сердца собаки
360
1:10
То же
То же сульфоксида. Режим замораживания: о, о
40 мин до +4 С, затем 1 /мин до о
-40 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание о 5 проводят на водяной бане при +37 С.
Жизнеспособность клеток после размораживания 70-80% по окрашиванию трипановым синим.
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микро-. плазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру 15 включения тимидиновой метки.
Пример. На 96-ячеечных гибких полихлорвиниповых пластинках сорбируют очищенную Са2+ -АТфазу — 2 мкг на ячейку в 100 мкл буфера ФСБ. После 20
2 ч инкубации при комнатной температуре лунки промъ|вают ФСБ, содержащим
0,05% "Твин 80" (буфер А). После трехкратной отмывки ячейку заполняют буфером А и инкубируют 1 ч при ком- 25 натной температуре или ночь при 4 С.
Для тестирования в ячейку вносят
100 мкл культуральной жидкости гибридомного клона, затем проводят 1 ч инкубацию и отмывку буфером А. 30
После этого в ячейку добавляют
100 мкл того же буфеоа, содержащего проявляющий реагент — меченые J антитела кролика к легким цепям иммуноглобулинов мыши (100 тыс. имп/мин). После 1 ч инкубации пластинки отмывают и ячейки просчитывают в гамма-спектрометре.
Са-АТфаза сердца собаки Штамм 1ЕЗ
Специфичность реакции моноклональных антител 1ЕЗ с Са + -ЛТфаэой показано в табл. 1, Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о высокой специфичности полученных ИонАТ к
Са2 -АТфазе сердца собаки.
Данные о способности МонАТ 1Е3 реагировать с Са + -АТфазой РС сердца и скелетных мъппц! а также клеточной мембраны эритроцитов приведены в табл. 2.
Результаты, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о том, что полученный гибридомный штамм продуцирует
ИонАТ, реагирующие с Са -АТфазой из сердца и скелетных мышц ряда лабораторных животных, а также из сердечной мъницы и эритроцитов человека.
Таким образом, полученные МОнАТ отличаются от известных способностью перекрестно реагировать с
Са -АТфазой СР сердца, а также эритроцитов человека. Это позволяет испольэовать данные МонАТ для диагностики патологий микромиокарда и сердечно-сосудистой системы, Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus
BCKK(II) 11! 96 D, используемый для получения моноклональных антител к
Са + -АТфазе саркоплазматического ретикулума сердца собаки. Таблица 1
1414870
Т а блица 2
Сердечная мышца морской свинки. 8050
Сердечная мьппца собаки
8090
Сердечная мьппца кролика
6640
Сердечная мьппца человека
6230
Скелетные мьппцы собаки
8850
Скелетные мьппцы кролика
11550
Скелетные мьппцы крысы
10190
Эритроциты человека
6280
Бычий сывороточный альбумин (KOHTpoJIb) 450
Составитель И. Серова
Редактор А. Козориз Техред А.Кравчук Корректор Г. Решетник
«
Заказ 4447
Тирам 520 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035,: Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Умгород, ул. Проектная, 4
Антиген (препарат, из которого выделена Са-АТфаза
Связывание меченых вторых антител, имп/мин
