Штамм гибридных культивируемых клеток животных мus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к митохондриальной креатинфосфокиназе человека

 

Изобретение относится биотехнологии и может быть использовано для диагностики инфаркта миокарда. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS mu scuJuSi продуцирующего моноклональные антитела {МКА) к митохондриальной креатинфосфокиназе человека (КФКмит). Штамп получают, гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных КФКмит, с клетками миеломы Х63-Ад«8-653. Клетки штамма культивируютв среде RPMI-1640 с 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10% лошадиной сыворотки при 37 С в атмосфере 5% 00. Продукция МКА на третий день культивирования составляет 50 мкг/мл. жание ША в асцитической жидкости 3-10 мг/мл. Препараты на основе МКА могут быть использованы для определения КФКмит в сыворотке крови больных при :дагностике инфаркта миокарда. 1 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

®сесоазрду ! l 3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

51 сю ° . -„..

««:«, ° % «, ф

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4213148/28-13 (22) 23.03,87 (46) 30.07.88, Бюп, У 28 (71) Казахский научно-исследовательский институт кардиологии (72) Т.С.Балмуханов и З,А.Хучуа (53) 578.085.23 (088,8) (54) ШТА2% ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ HUS HUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К МИТОХОНДРИАЛЬНОИ КРЕАТИНФОСФОКИНАЗЕ ЧЕЛОВЕКА .(57) Изобретение относится биотехно-. логии н может быть использовано для диагностики инфаркта миокарда. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных HL!5 AlLfscU1Usg продуцирую„SU„„1413132 А1 (g) 4 С 12 и 5/00, А 61 К 39/395 щего моноклональные антитела (ИКА) к митохондриапьной креатинфосфокиназе человека (КФКмит}, Штамп получают. гибридизацией спленоцитов мышей линии ВА1.8/С, иммунизированных КФКмит, с клетками миеломы Х63-Ад 8-653, Кпетки штамма культивируют в среде

RPN-1640 с 1ОХ телячьей змбриональной сыворотки, !ОХ лошадиной сыворотки нри 37 С в атмосфере 5Х СОа ° Продукция МКА на третий день культиви- рования составляет 50 мкг/мл. Содержание МКА в асцитической жидкости

5-!О мг/мл. Препараты íà oeaose MKA могут быть использованы для определе- ния КФКмит в сыворотке крови больных ф при:дагностике инфаркта миокарда.

1 табл.

1413132

Изобретение относится к биотехноЛогии и может быть использовано для диагностики инфаркта миокарда.

Целью изобретения является полу5 чение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, 6родуцирующего моноклональные антитела (MKA) к митохондриальной креатинфосфокиназе человека (КФКмит)

Штамм получают следующим образом.

Иышей линии ВА1В/С иммунизируют ,трижды по 100 мкг КФКмит в 200 мкл ,эабуференного фосфатами физраствора

, (3ÔÐ) внутрибрюшинно, Через три дня после третьей иммунйэации клетки селезенки мыши с наиболее высоким .титром антител в сыворотке крови ,, (1:50000 по радиоиммунологическому анализу) используют для слияния 20 с клетками миеломы X63-Ag.8-653, !

Слияние проводят при помощи полиэти,ленгликоля мол.массы 3350„ Отноше,ние клеток спленоцитов к миломным клеткам составляет 5:1, После гибри- 25 дизации клеток высевают н 96-луноч5

: ные планшеты по 2 ° 10 клеток в лунку.

Селекция гибридных клеток обеспечивается применением селективной среды

: ГАТ:RPNi-1640 с добавлением 10 лошадиной, )О телячьей эмбриональной

; сыворотки 4, мМ 1 -глютамина, 10 мМ пирувата натрия, 100 мкг пенициллина, 100 мкг стрептомицина, аминокислотами для баэальной среды Игла, 0,05 мМ меркаптоэтанола, 10 М гипоксантина, 4. 10 7 М аминоптериана, 1,6 ° 10 М тимидина, Дальнейшее культивирование . проводят на среде ВРМ1-1640, 40

Скрининг гибридом йроводят на гибких планшетах из поливиннлхлорида методом радиоиммунологического анализа, используя меченные иэотопом

Я6 йода 1 кроличьи антитела к иммуно- 45 глобулинам мыши. Дважды ответившие положительно первичные популяции подвергают клонированию и реклонированию, после чего 100Х сублоконов продуцируют NKA к, КФКмит, 50 г

Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают

А-КФК-5Н12, Штамм А-КФК-5Í12 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток животных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (Н) 1130 и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда культивирования — среда

RPM1-1640 с 10 телячьей эбриональной сыворотки, 10 лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мгк/мп стрептомицина, 10 мИ пирувата натрия, аминокислота- ми для базальной среды Игла, 0,053 меркаптозтанола. Для выращивания штамма используют пластиковую посуду, посевная доза 100000 кл/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева i:5. Культура суспензионная. Клетки культивируют при

37 С в атмосфере 5 СО<. Дпя выращивания опухоли пригодны мыши линии

BALB/С, которым .не менее чем эа три дня до инъекции штамма вводят внутри. брюшинно по 0,5 мл пристана. Штамм

6 вводят внутрибрюшинно по 3 ° 10 клеток на мышь в 1 мл среды RPN1-1640.

Асцитная опухоль развивается через

15-20 дней, Продуктивность штамма.

Секреция МКА на третий день культивирования составляет 50 мкг/мл среды. Содержание ИКА в асцитической жидкости 5-10 мг/мл. Стабильная продукция антител сохраняется до ll пассажей 1и v l tf 0, (Характеристика полезного продукта.

МКА относятся к классу lg Gl они специфически связываются с КФКмит.

Контаминация.

Бактерии и грибы не обнаружены при длительном наблюдении в культуре при посевах на питательные среды.

Заражения микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДИК и тимидиновой метке культуральной среды.

Криоконсервирование.

2-5 10 клеток штамма консервируют в 1 мл телячьей эмбриональной сыворотке с добавлением 10 диметилсульфоксида в пластиковых ампулах, Замораживание проводят в программном замораживателе по следующей программе: 4 мин до 4 С и по li С мин до

-40 С, после чего переносят в жидкий азот для хранения, Размораживание проводят быстро при 37 С в водной бане. Жизнеспособность клеток после размораживания по включению трипаиового синего — 60-70Х, Пример 1. В каждую лунку 96луиочного планшета иэ полистирола

14131

Штамм

А-КФК-5Н12 8,5 7,7 7,4 ?,2 6,9 6,6 6,2. 4,6 4,0

А-ЛПНП-4Н8 1,7 1,5 1,0 0,7 0,7 0,8, 0,6 0,7 0,6 (ИФМА) или полихлорвинила.(РИА) вносят 1 мкг антигена в 100 мкл ЗФР о и инкубируют ночь при 4 С, после чего промывают четыре раза 0,05Х-ным раствором Твин!а 20 в ЗФР, и оставляют планшет на 1 ч при комнатной тем-. пературе под этим раствором, затем его сливают и в лунки вносят антитела на 1 ч. После инкубации раствор 10 антител сливают, промывают четыре раза Твин ом в ЗФР и вносят проявляющие поликлональные антитела кролика

K иммуноглобулинам мьппи, ковалентно связанные с пероксидаэой хрена (ИФМА) !5 или радиоактивно меченные изотопом йода (РИА), Результаты оценивают по интенсивности окраски в лунках после добавления субстрата пероксидазы - перекиси водорода в присутствии 20 хромогена — ортофенилендиамина при проведении ИФАМ и при помощи гаммасчетчика при постановке РИА.

Результаты опыта по изучению специфичности связывания MKA с КФКмит 25 приведены в таблице, В каждую лунку вносят антитела кролика к иммуноглобулинам мыши с ра-: диоактивностью 5,7 10 распадов в 30 минуту, Фон, т.е. лунки, где вместо антител вносят 0,2 -ный раствор бычьего сывороточного альбумина—

500 расп/мин. В качестве контроля используют штамм 4Н8, синтезирующий антитела к другому антигену (ЛПНП), Результаты, представленные в таблице свидетельствуют о высокой cnel цифичности взаимодействия полученных

МКА с КФКмит. 40

H p и м е р 2. Для количественного определения содержания в растворе

КФКмит, используя NKA постановку, осуществляют при помощи ИФМА, а именно используя конкурентный метод. На по- 45 (32 листироловый планшет наносят МКА к

КФКмит после четырех промывок (0 05X

Твин 20 в ЗФР), блокируют свободную поверхность пластика 0,2Х-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в ЗФР и вносят смесь КФКмит и

КФКмит, коньюгированной с пероксидазой хрена. Чем вьппе содержание

КФКмит в тестируемом растворе, тем ниже интенсивность окраски в луцке после добавления субстратной смеси.

КФКмит титруют на фоне пулированной сыворотки крови здоровых доноров.

Результаты выражены отношением В/Ву,,где В - интенсивность окраски при различных количествах КФКмит в про,бе, В - интенсивность окраски в пробе, где КФКмит не внесена (при

492 нм, Bo = 0,35):

Количество КФКмит, . В/Вп нг 100.мкл

4000.00 0,09

800.00 0,32

160.00 0,59

32.00 0,78

6.40 0,86

1,28 0,94

0.00 1,00

Результаты, представленные в таб-, лице 2, подтверждают высокую специ.фичность взаимодействия .полученных

МКА с КФКмит в растворе, что нозволяет использовать МКА для клинических определений в случае подозрения миокарда.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Ипз пшзси1из

ВСКК(П) Р 113D используемый дпя получения моноклоиальных антител к митохондриальной креатинфосфокинаэе человека.