Способ получения пептидов и белков в бесклеточной системе трансляции

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к использованию бесклеточньгх систем трансляции для синтеза биологически активных полипептидов и белков in vitro. Целью изобретения является повышение выхода целевого про .дукта за счет увеличения срока работы системы трансляции. Способы получения полипептидов в бесклеточных системах трансляции обладают рядом преим:,1деств как по сравнению с химическими методами (отсутствие необходимо- . сти защиты активных групп, высокая оптическая чистота продукта, относительно низкая cToTtMOCTb и др.), так и по сравнению с вариантами, в которых используются генно-инженерные мегоды (предотвращение возможности деградации целевого продукта, отсутствие ограничений в отношении природы синтезируемого полипептида и др.). Основным недостатком всех известных способов синтеза палипептидов с использованием клеточного аппарата трансляции является их низкая эффективность . Предложенная совокупность методических приемов (нейрерное удаление из сферы реакции синтезированного продукта-, непрерывное восстановление расходуемьгх в реакции низкомолекулярных веществ и введение системы регенерации АТР и GTP) обеспечивает функционирование аппарата трансляции в длительном режиме и общее повьппение зффективности процесса в несколько десятков раз. Благодаря этому новый способ синтеза полипептидов в бесклеточной системе может применяться для препаративных целей. Особо важным представляется использование изобретения для получения полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков , т.к. производство их химическим путем является дорогостоящим, а синтез при помоп(и методов генной инженерии - во многих случаях малодоступным . 2 ил. § (Л ( 00

СОЮЗ С0ВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСГ1УбЛИН

„.SU„„1441

А1 (51) 5 С 12 Р 21/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

И АВТОРСНОММ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (4 6) 23, 09. 90, Бюл. № 3 5 (21) 4239148/31-13 (22) 29.04.87 (71) Институт белка АН СССР (72) 10.Б.Алахов, В.И .Баранов, С.Ю.Оводов, Л.A.Ðÿáoâà и.А.С.Спирин (53) 577.217.3(088 ° 8) (56) Roberts В.Е. and Paterson В.М. (1973), PNAS, ч. 70, № 8, р. 23302334. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ ТРАНСЛЯЦИИ (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к использованию бесклеточных систем трансляции для синтеза биологически активных полипептидов и белков in vitro. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет увеличения срока работы системы трансляции. Способы получения полипептидов в бесклеточных системах трансляции обладают рядом преимуществ как по сравнению с химическими методами (отсутствие необходимо. сти защиты активных групп, высокая .оптическая чистота продукта, относительно низкая стоимость и др.), так и по сравнению с вариантами, в которых используются генно-инженерные методы (предотвращение возможности деградации целевого продукта, отсутствие ограничений в отношении природы синтезируемого полипептида и др.).

Основным недостатком всех известных способов синтеза полипептидов с использованием клеточного аппарата трансляции является их низкая эффективность. Предложенная совокупность методических приемов (нейрерное удаление из сферы реакции синтезированного продукта, непрерывное восстановление расходуемых в реакции ниэкомолекулярных веществ и введение системы регенерации ATP и GTP) обеспечивает функционирование аппарата трансляции в длительном режиме и общее повыше4g ние еффектиености процесса е несколь- Я ко десятков раэ. Благодаря этому новый способ синте за полипе птидов в ( бесклеточной системе может применяться для препаративных целей. Особо важным представляется использование изобретения для получения полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков, т.к ° производство их химиМц ческим путем является дорогостоящим, а синтез при помощи методов генной инженерии — во многих случаях мало- QO доступным. 2 ил. f 1441787

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к использованию бе скле точных сис1тем трансляции для синтеза биологически активных палипептидов in vitro.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет увеличения срока работы системы трансляции. 1О

В настоящее время разработан целый ряд бесклеточных систем трансляции на основе клеточ1ьых экстрактов из различных прокариотических и эукариотических организмов. Все эти системы f5 характеризуются низкой эффективностью процесса и обычно обеспечивают синтез лишь нескольких,молекул полипептида на рибосаму. Основные причины столь низкой эффективности бескле-20 тачньзх систем трансляции состоят в следующем:

1) бесклеточные системы трансляции содержат ограниченное калззчества суб.— .>). стратов реакции, в перззую очередь ис — - точников энергии (АТР .и ОТР) .. Повышение содержания этпх помпоне нтозз в системах имеет определен111,1е rtpe Item при превь1шении которых наб)подается ингибирование системы трансляции; 36

2) продукты распада субстратав реакции, в первую очередь ADP, АМР, GDP фосфать1 и пирафасфаты являются ингибиторами системы транс,пяции, 3) сами продукты синтеза (полипеп-3 тиды) также могут бьзть ингибитарами отдельных стадий бесклетачнай системы урансляции.

В настаязцем изобретении указанные причины устраняются за счет неирерыв- @ ного отвода из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывного восстановления исходной концентрации низкомалекулярных веществ, расходующихся в процессе трансляции. 45

Основ ная реакция (синтез ) палипептида протекает в блоке 1 (фиг.1) . В результате ее расходуются свободные аминокислоты, ATP u GTP и образуются полипеитид, ANP GDP и неорганический 5(1 фосфат. Для предотвращеьп1» остановки процесса из бзлока 1 происходит одновременна отбор GDP, ЛЙР и Pt. и подача

GTP, ATP и аминокислот иэ блока 2.

Отбор синтеэируемога палипептида пра-55 исходит (I3 bJII>11e 3) через ме tt>pBIIv в резервуар, из которого буферный раствор с полипептидам наступает в колонку с аффинным иммунасарбентам.

На колонке происходит вдсорбция полипептида па иммунном сорбеите, специфичном к целевому полипептиду. Для более экономичной работы системы в блоке 4 происходит превращение образовавшихся ЛИР и GDP в ЛТР и СТР. Г>уферный раствор из блока З.после адсорбции полипептида также проходит через систему регенерации ATP u GTP и через полупроницаемую мембрану . вновь поступает в реакционную смесь.

Н р и м е р 1. Синтез белка обопочки вируса мозаики костра (BNV) на матрице BNV РНК 4 в эукариотической системе трансляции из зародьшзей пшеницы в стандартной системе и в установке непрерывнага действия.

Раствор (A> состоял иэ 20 мИ НЕРЕ$, рН 7, 6; 2, 1 мИ Hg (аЛс)„, 115 MN

КОАс, f мИ ЛТР, 25 мкИ СТР, 250 мкИ спермидина- 25 мкИ Г"- H ) лейцина с удельной радиоактивностью 24 Ки/ммоль и 25 мкИ каждой из остальных 19,аминокислот. 3 мл Инкубационной смеси, пригатовлеинаи на растворе (Л), сод .p;êà)ltt 80 пикамалей 80$ рибасам, 20 пикамолей BNV РНК 4, 3„7 оп.ед. белкоззай фракции $100, 150. ед. активности ингибитора рибануклеаз из плаценты человека, 0,1 мкг .пейпептина, О, 1 мкг апратенина, О, 1 гпсг пепстатина, 0,1 мкг химастатина, Кинетика синтеза белка оболочки в стандартной системе при 25 С представлена на фиг.2 (кривал 1).

В параллельном эксперименте в установке 11ellpeрьпзнаго действия к 3 мл тай же и11куб)ациоиной смеси непрерыдна пала)за)?сл раcòÂÎp (А) сО скоростью

0„6 мл/ч, а прадуктьз реакции отводились иэ реакционной смеси с той же !. скоростью через ультрафильтрацианную мембрану ХЪ1-50. В результате в камеру, содержащую бесклеточную систему трансляции. непрерывно подавались субстраты реакции (ATP, GTP, аминокислоты) и отводились иэ нее продукты реакции (АИР, GDP, Р1, синтезиро1)аипый белок оболочки). Кинетика син.те,а белка оболочки в такай системе при 25 С в течение 15 ч гредставлена на tl)III 2 (кривая 2) .

Из сравнения кинетических кривых 1 и 2 tta фиг.2 )1ажиа сделать следующие вывОды:

Стандартна» beeê>teòî÷ttàÿ система трансляции выходит. Иа плато по синтезу белка через 1; 5 1, Каличестззо син787

Способ получения пептидов и белков в бесклеточной системе трансляции с использованием матричных РНК с последукщим выделением и очисткой конечного продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьппения выхода целевого продукта эа сче т уве,личения срока работы системы трансляции, осуществляют непрерывное удаление из реакционной смеси синтезированного продукта, непрерывное восстановление концентрации расходуемых ниэкомолекулярных веществ аминокислот, ATP, GTP, регенерацию ATP GTP из образующихся АМР n GDP с последующим возвращением ре ге нерированных

ЛТР и GTP в систему трансляции. з

1441 теэированного белка при этом составляет 0.,76 пикомолей белка оболочки на 1 пикомоль рибосом.

В установке непрерывного действия

5 синтез белка оболочки идет линейно в течение исследованного интервала времени (15 ч) и количество синтезированного белка за 15 ч составило

40 пикомолей на 1 пикомоль рибосом. 1р

В целом для предложенной модели установки непрерывного действия эффективность синтеза белка за 15 ч возросла более чем в 50 раз.

Пример 2, Синтез белка оболочки фага MS 2 на матрице MS 2 PHK в прокариотической системе трансляции E. coli в стандартной системе и в -установке непрерывного действия.

Раствор (А) содержал 20 мМ Tris- 20

НС1, рН 7,4, 10 мМ MgC1, 100 MM

НН С1, 1 MM АРТ, 0,2 мМ GTP, 5 мМ креатин фосфата, 10 мкг/мл кр. фосфат киназы, 25 мМ Г С 7 лейцина с удельН0Н радиоактивностью 348 мки/ммоль и 25

25 мкМ каждой из остальных аминокислот, 3 мл Инкубационной смеси, приготовленной на буфере (А), содержали

1 наномоль рибосом 70S, i нсномоль

MS2 РНК, 3,5 ед. А,, белковой 30 фракции S100.

В параллельном эксперименте в установке непрерывного действия к 3 мл той же инкубационной смеси непрерывно подавался раствор (А) со скоростью

О, 5 мл/ч, а продукты ре ак ции. о тводились иэ реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтра 1ионную . мембрану PM-30. В результате в камеру, . содержащую бесклеточную систему тран- 4р сляции, непрерывно подавались субстраты реакции (ATP, GTP, аминокислоты) и отводились продукты реакции (AMP, GDP, P., синтезированный белок).

Стандартная бесклеточная система трансляции выходит на плато по синтезу белка через 2 ч. Количество синтезированного белка при этом составляет

1, 1 пикомоля белка на 1 пикомоль рибосом.

Сравнивают кин< тику синтеза белка оболочки в такой системе нри 37 С B течение 15 ч с кинетикой синтеза в стандартной бесклеточной системе °

В установке непрерывного действия в течение 15 ч синтеэировано 11 пикомолей белка на 1 пикомоль рибосом °

Таким образом, предложе нный способ синтеза полипептидов в бесклеточной системе трансляцип обеспечивает многократное nîâbøåíèå скорости реакции и функционирование системы в длительном режиме. В результате этого выход целевого продукта повышается в несколько десятков раэ (по сравнению с прототипом) .

Достигаемая эффективность процесса позволяет испопьэовать способ для препаративного синтеза активных полипептидов и белков. Особо важное хозяйственное значение может иметь получение этим способом полипептидов длиной 5-50 аминокислотных остатков, поскольку производство их химическим путем является крайне дорогостоящим, а для методов генной инженерии — во многих случаях маподоступным.

Формула изобретения

1441 737

Составитель О. Скуратовская

Техред Л..Олийнык Корректор И.Иаксимишинец

Редактор Т. Пилипенко

Заказ 3328

Тирай 478 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ултород, ул. Проектная, 4