Способ получения экстракта, обладающего иммуномодулирующим действием, из животного сырья

 

Изобретение относится к медицине , точнее к способам получения ле- , карственных средств. Цель изобретения - упрощение технологического про-, цесса. Для этого порцию тимуса теленка измельчают до кашицы, к ней добавляют апирогенную бидистиллированную воду и в проточном нагревателе осаждают высокомолекулярные составные части 10 мин при . Затем кашицу охлаждают и центрифугируют. К надосадку добавляют для непрерывной ультрафильтрации апирогенную воду. Ультрафильтрат подвергают электродиализу 2 ч при , напряжении 12 В, максимальной силе тока АО А. Выход экстракта составляет 1,6-1,54%., §

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

SU„„42 64 (51)4 А 61 К 37 24

4(ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ! /

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbITI44 (21) 3798785/28-14 (22) 04. 10,84 (31) 5413/83 (32) 05.10.83 (33) SZ (46) 30.11.88, Бюл. Ф 44 (71) Золько Базель АГ (SZ) (72) Роберт Оэртли (SZ) (53) 615,7.577.15 (088.8) (56) Annals New Jork Academy of

Sciences, 1975, II 249, р.124-144. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА, ОБЛАДА16ЦЕГО ИММУНОМОДУЛИРУ16ЦИМ ДЕЙСТВИЕМ, ИЗ ЖИВОТНОГО Cblpbfl (57) Изобретение относится к медицине, точнее к способам полученйя лекарственных средств. Цель изобретения — упрощение технологического про-. цесса. Для этого порцию тимуса теленка измельчают до кашицы, к ней добавляют апирогенную бидистиллированную воду и в проточном нагревателе осаждают высокомолекулярные составные части 10 мин при 80 С. Затем кашицу охлаждают и центрифугируют. К надосадку добавляют для непрерывной ультрафильтрации апирогенную воду.

Ультрафильтрат подвергают злектродиализу 2 ч при 30 С, напряжении

12 В, максимальной силе тока AO А.

Выход экстракта составляет 1,6-1,54%., 1442064

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения лекарственных средств.

Цель — упрощение технологического процесса.

Пример 1. 5 кг тимуса теленка, освобожденного от жировых тканей и хранящегося при температуре — 25 С, измельчали в мясорубке до кашицы. К кашице добавили 5 л апирогенной, бидистиллированной воды и в проточном нагревателе осаждали высокомолекулярные составные части в течение

10 мин при 80 С. После этого кашицу охлаждают и центрифугируют. К надосадку добавляют для непрерывной ультрафильтрации еще 10 л апирогенной воды (поверхность мембраны 2,5м, 2

PN-10 система Ромикон HF 1/3S). Ульт- 20 рафильтрат, выпаренный до объема 1л, подвергают электродиализу при полной поверхности мембраны 444 см в тече2 ние 2 ч при постоянной температуре

30 С, напряжении 12 В, максимальной силе тока 40 А. Выход экстракта равен .58 г (1, 167) .

Пример 2. 250 кг свежих селезенок здоровых телят (жировая ткань удалена). Замороженные куски гомогенизировали в волчке для мяса. Полученную кашицу нагревали с 250 л апирогенной воды в непрерывном нагревателе (длина трубки 20 м) в течение 5 мин до 80 С, затем охлаждали в непрерывном охладителе в тео чение 6 мин до 4 С. Центрифугировали. Надосадок подвергли ультрафильтрации непрерывно при добавлении 900 л апирогенной воды (м.в. <10 000 дальтон). Ультрафильтрат испарили в циркуляционном испарителе и после это" го стерилизовали. Концентрат селезенки порциями по 5 л подвергали электродиализу при поверхности мембраны 1776 см, постоянной темпера4S о туре 37 С, постоянном напряжении

50 В, максимальной силе тока 45 А в течение 3 ч. Проведение способа осуществили в закрытой системе. Выход

3850 r (1,547).

Пример 3. Эпителиальные клетки эмбриональных точек теленка (FKNE) культивируют в подвижных бутылях да

850 мл с "минимальной эссенциальной средой" и 77 эмбриональной сыворотки теленка. Незадолго до образования закрытого клеточного покрова, последний промывают раствором поваренной соли (рН 7,2) и освобождают иэ подвижных бутылей с помощью этилендиаминтетраацетата воды, а также резинового скребка и помещают в 4 л бидистиллированной апирогенной воды.

Клетки FKNE (4 10 (Mxt) растворяют и размельчают в 100 мл порций ультразвуком ("Сонипреп" 150 : амплитуда к

4, средняя частота/ в течение 1 мин.

Клеточную массу FKNE нагревают с 4 л воды в проточном нагревателе,до темо пературы 80 С и через 10 мин охлаждают до температуры 10 С. Денатурированные белки и другие нерастворимые клеточные вещества отделяют путем центрифугирования в Sorva11-центрифуге с проточным ротором TZ — 28 (?0000 об/мин, дпительность обработки 10 мин). Затем надосадочную жидкость непрерывно подвергают ультрафильтрации с 8 л бидистиллированной и апирогенной воды (граница м.в.

7 l0 000).

Ультрафильтрат концентрируют до

500 мл и подвергают электродиализу.

Выход 55 мг на 100 мл культуры (0,67X) .

Пример 4. Сыворотка крови теленка.

К 6 л сыворотки из свежей крови теленка подают 3 л свободной от пирогенов воды. Эту суспензию нагревают в проточном нагревателе до температуры 75 С, выдерживают в течение

5 мин при одинаковой температуре и затем охлаждают в подобной системе трубы до 4 С. Осажденные вещества отделяют путем центрифугирования.

Надосадочную жидкость объемом 5,5 л непрерывно подвергают ультрафильтрации путем подачи 15 л свободной от пирогенов воды (м.в. 10 000 дальтон), После значительного удаления солей при помощи электродиализа получают стерильный и свободный от пирогенов раствор. Этот низкомолекулярный экстракт сыворотки способствует нормализации полиферации в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре.

Пример 5. Свежая кровь теленка.

5 л свежей крови теленка перемешивают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе до темо пературы 80 С. Через 3 мин постоянной температуры суспензию охлаждают о в проточном охладителе до 4 С и удаляют осажденные продукты путем цент3 ° 144 рифугирования. Надосадочную жидкость объемом 6 л подвергают непрерывной ультрафильтрации .подачей 18 л свободной от пирогенов воды (м.в, « 10 000 дальтон). После значительного удаления солей путем электродиализа полу.чают стерильный, свободный от пирогенов раствор. Полученный, таким образом, низкомолекулярный экстракт из крови теленка способствует нормализации пролиферации в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре.

Пример 6. Дефибринированная кровь теленка.

5, 1 кг дефибрированной крови теленка нагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагревао теле до температуры 80 С и выдерживают в течение 5 мин при одинаково высокой температуре. Затем кашицу охлаждают в проточном охладителе до о температуры 4 С и удаляют осажденные вещества пви помощи центрифугирования. Надосадочную жидкость объемом

7 л непрерывно подвергают ультрафильтрации подачей 18 л свободной от пирогенов воды (м.в. (10 0СО дальтон), После осуществления электроди.алиэа получают обедненный солями, стерильный и свободный от пирогенов концентрированный раствор. Раствор способствует нормализации полиферации в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре.

Пример 7. Спинной мозг теленка. предельной дезокситрасферазы в клет- ках костного мозга.

Пример 8. Мозг иэ бедренных

5 костей.

Кашицу из 3,5 кг мозгов и из 30кг бедренных костей свежеэаколотых телят нагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе

10 до температуры 75 С. Полученную суспензию выдерживают в течение 5 мин.

После охлаждения в проточном охладителе застывший жир отделяют от оставшегося раствора. После центрифугиро15 вания обезжиренного раствора надосадочную жидкость объемом 5 л непрерывно подвергают ультрафильтрации подачей 15 л свободной от пирогенов воды (м.в. а 10 000 дальтон). Из концентрированного препарата путем электродиализа вьщеляют ионы соли. Обедненный солями раствор является стерильным и свободным от пирогенов. Раствор способствует нормализации пролифера25 ции в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре, и повышению активности предельной дезокситрансферазы.

Пример 9. Плацента овцы.

4,700 кг кашицы из сильнозаморо30 женных розеток свежей плаценты овцы нагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе до температуры 80 С и выдерживают в течение 5 мин в процессе циркуляции. о

После охлаждения до температуры 4 С отделяют вещества, выпавшие в осадок, путем центрифугирования и надосадочную жидкость объемом 7 л подвергают ультрафильтрации непрерывно при по40 даче 10 л свободной от пирогенов воды (м.в. - . 10 000 дальтон). Полученный путем злектродиализа обедненный слоями раствор был стерильным и свободным от пирогенов. Раствор способ45 ствовал нормализации пролиферации в фибробластах обратимо поврежденных в культуре.

Пример 10. Тимоциты.

10 кг свежих органов эобной желе50 зы теленка растирают с 10 л раствора поваренной соли (pH 7,2) с фосфатными буферными свойствами в мелкоячеистом сите резиновой пробкой. Вследствие этого из тканей органов отделяют тимоциты, оставшиеся ча,.ти тканей

55 выбрасывают. Затем тимоциты дважды промывают раствором поваренной соли с фосфатными буферными свойствами и затем помещают в 10 л бидистиллироИз костей позвонка свежеэаколотого здорового теленка изолируют 5 кг мозга и нагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагрео вателе до температуры 80 С и выдерживают в течение 5 мин в постоянной температуре. Затем кашицу охлаждают в проточном охладителе до температуры 4 С. После центрифугирования о

1/3 объема, как надосадочную жид-кость, используют непосредственно для следующей ступени. 3 л подвергают ультрафильтрации с 9 л свободной от пирогенов воды (м.в. < 10 000 дальтон).

Иэ концентрата путем. электродиалиэа выделяют ионы соли. Обедненный солями раствор был стерильный и свободным от пирогенов. Он способствовал нормализации пролиферации в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре и повышению активности

) 2064 4

Формула и з о б р е т е н и я

Составитель Л.Покрышкина

Техред А.Кравчук Корректор И.Максимишинец

Редактор Ю.Середа

Заказ 6297/58 Тираж 655 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, 3-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

14420 ванной, свободной от пирогенов воды ,, (18 -10 клеток/мл). Тимоциты растворяют и размельчают 100 мл порциями ультразвуком (Сонипреп 150 : Амплитуда 4, средняя частота) в течение

I мин. Кашицу из тимоцитов нагревают с 10 л бидистиллированной свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе до температуры 80 С и через l0 мин снова охлаждают до температуры 10 С. Денатурированные белки и другие нерастворимые клеточные вещества отделяют путем центрифугирова . ния в Sorvall-центрифуге с проточным ротором TZ-28 (20 000 об/мин, длительность обработки 10 мин) . Затем надосадочную жидкость непрерывно подвергают ультрафильтрации еще с 20 л бидистиллированной, свободной от пирогенов воды (Граница растворения м.л. ) 10 000). Ультрафильтрат концентрируют до 2 000 мл и подвергают электродиализу. Продукт, содержащий пептицы, проявляет в СО поврежденных фибробластах активность, стимулирующую рост.

Пример 11. Культура фибробластов.

Человеческие кожные фибробласты (клеточная линия CCL-1222) культивируют во вращающихся бутылочках объемом 850 мл со средой КРИТ и 107. внутриутробной телячьей сыворотки. От связанного слоя клеток отделяют среду и клеточный слой обмывают два раза раствором поваренной соли, имеющей кислотность рН 7,2.

Клетки отделяют с помощью резинового шибера со стен бутылок и поме40 щают в 0 5 мл воды на квадратный сантиметр, всего в 4 л воды. Порциями в

64 6

100 мл еще интактные клетки закрывают и размельчают в течение 1,5 мин с помощью ультразвука (Сонипреп-150, амплитуда 4, средняя частота) .

Кашицу из клеток быстро нагревают в следующих 4 л воды до 90 С и спустя 3 мин снова охлаждают до 4 С, Денатурированные протеины и фрагменты клеток отделяют с помощью Sorvallцентрифуги с ротором ТЦ-28 (20000 об/мин, время 10 мин) . Ультрафильтрованную выстоявшуюся жидкость (предельная величина м.в. > 10000) сгущают до 500 мл. Часть солей удаляют с помощью электродиализа. Содержащий малое количество солей клеточный экстракт оказывается не пирогенетическим и вызывает при обратимых поврежденных фибробластах быструю нормализацию пролиферации.

1 ° Способ получения экстракта, обладающего иммуномодулирующим действием, из животного сырья путем гомогенизации сырья, нагревания гомогената и его охлаждения, осаждения надосадка с последующим удалением балластных белков ультрафильтрациеи и отделением солей, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа, удаляют белки с молекулярной массой выше 10000 дальтон, а отделение солей проводят электродиализом при 30-40 С.

?. Способ по п.1, о т л и ч а— ю шийся тем, что в качестве сырья используют клеточные культуры, гомогенизацию которых проводят,. ультразвуком.