Способ определения гидрофобности белков

 

Изобретение относится к области физико-химической биологии и биотехнологии и позволяет повысить разрешающую способность и точность анализа при исследовании физико-химических и функциональных свойств биополимеров. Гидрофобность белковых компонентов гетерогенного белка определяет после электрофоретического деления в полиакриламидном геле и денатурации их по интенсивности связывания детергента - додёцилсульфата натрия и рассчитывают количество додецилсульфата натрия (мкг) на 100 мкг белка. 1 т абл. (Л «и сд О1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (19) (И) (5Р с1 G 01 N 33/48 - -"ГГ,"3;., ., ПАТЕЛ, Б;:,Ь,, 1, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4123726/30-13 (22) 25.09.86 (46) 15.01.89. Бюл. 1l 2 (71) Казахский научно-исследовательский институт земледелия им. В.P,Âèëüямса (72) И.B.Перуанский и И.М.Савич (53) 577.15 (088.8) (56) Kata А., Matsuda T., Matsudomi N., Kobayshi К., Determination

of Protein Hyoirophobici Using

Sodium Dodecyl Susfate Binding Me-ho

thod. — J.Agric. Tood Chem, 1984, 32, И 2, 284-288.

Kafo А., Nakai S. Hydrophobicity

determind i fy à Fluorescence Probe

method and its correlation Mith sur-

face properties of oroteins. — Bi- °

ochem, et Biophys. Acta, 1986, 624, В 1 1320, Reynolds J.A,, Tanford С., The

Iross Copformation of Protein — sodium Dodecyl sulfate Compeexes.—

J, Biol Chem, 1970, 245 ° У 19, 5761-5765. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРОФОБНОСТИ БЕЛКОВ (57) Изобретение относится к области физико-химической биологии и биотехнологии и позволяет повысить разрешающую способность и точность анализа при исследовании физико-химических и функционапьных свойств биополимеров.

Гидрофобность белковых компонентов гетерогенного белка определяет после электрофоретического деления в полиакриламидном геле и денатурации их по интенсивности связывания детергента — додецилсульфата натрия и рассчитывают количество додецилсульфата натрия (мкг) на 100 мкг белка.

1 табл.

1451599.

Изобретение относится к области физико-химической биологии и битехнологии, а именно к биологической и аналитической химии и может быть

t 5 и спольз он ано научными учреждениями, для изучения структуры физико-химических, функциональных свойств биополимеров и природных соединений.

Целью изобретения является усиле- 10 ние разрешающей способности и повышение точности анализа при исследовании физико-химических и функциональных свойств белков.

Способ заключается в том, что про. — f5 водят разделение. гетерогенного белка на фракции методом электрофореза в полиакриламидном геле с одновременным концентрированием фракций в небольшом объеме. Гидрофобность 20 компонентов гетерогенного белка оп.ределяют после их денатурации трихпоруксусной кислотой в геле путем окрашивания метиленовым голубым после обработки детергентом — додецил- 25 сульфатом натрия.

Пример. Препарат зеина, полученного из эндосперма кукурузы, в количестве 200-300 мкг наносят на каждую из трех дорожек и подвергают Зр электрофоретическому разлелению в попиакриламидном геле.

Пластину геля помещают для денатурации разделенных белковых компонентов эеина в 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты на 1 ч. Затем раствор кислоты сливают и операцию повторяют еще раз. Одну из дорожек вырезают из ппастины и окрашивают 0,05Хным раствором кумасси R-250 в тече- 40 ние 90 мин отмывают дорожку от избытка красителя дистиллированной водой и интенсивность окраски белковых компонентов определяют денситометрически (вариант в).

Пластину геля с оставшимися двумя дорожками обрабатывают 0,02 М натрийфосфатным буфером рН 7,0 в течение

1 ч, Раствор смывают и операцию повтоРЯют до тех поР пока РН пРомывного 1- р .50 буфера не достигнет нейтрального значения, Дорожки отделяют друг от друга и одну из них окрашивают 0,002-0,004Хным раствором метиленового голубого в течение 2 ч. После этого гель отмывают от избытка красителя дистиллированной водой и определяют интенсивность окраски белковых компонентов денситометрически (вариант б), Другую дорожку обрабатывают 0,140,20 мМ додецилсульфата натрия в течение 2 ч. Затем освобождают гель от избытка детергента промывкой натрийфосфатным буфером рН 7,0 (пять раз по 1 ч) и гель окрашивают так же, как и в варианте б, и проводят денсит ометрию (в ари ант а) °

Все операция с гелями проводят на качалке при,постоянном режиме встряхивания и комнатной температуре.

Расчет гидрофобности белковых компонентов приведен в таблице.

Количество белка в группе компонентов и количество додецилсульфата натрия (ДДС->На), связанного с белком

1 находят по соответствующим стандартным калибровочным кривым. 1"идрофобность групп белковых компонентов определяется количеством ДДС-Ма, связанным 100 мкг белка. чем выше значения такого показателя, тем более гидрофобным является белок, Известный способ позволяет определить лишь суммарную гидрофобность препаратов белков, а предлагаемый, способ после электрофоретического разделения позволяет дифференцировать по гидрофобности составляющие препарат компоненты и группы компонентов, Повышение точности анализа достигается тем, что после электрофореза имеется возможность определить гидрофобность низкомолекулярных компонентов, которые по известному способу могут теряться в процессе диализа препаратов белка.

По прототипу суммарная ° гидрофобность препарата зеина составила

0,90 мкг ДДС-Na на 100 мкг белка, а после электрофореза 0,80 мкг ДДС-Na на 100 мкг белка. При этом следует учитывать, что в полиакриламидный гель часть высокомолекулярных белков зеинового комплекса не входит.

Таким образом, предлагаемый способ определения гидрофобности белковых компонентов по сравнению с известным имеет следующие преимущества: не требует для своего выполнения дорогостоящих приборов и дефицитных реактивов, позволяет определять гидро14515 фобность составных частей гетерогенных белков, более чувствителен.

100 А-В

С где А и  — количества додецилсульфата натрия, связавшегося с первой и второй дорожками соответственно, мкг;

С - количество белка в данной пробе, определенное по окрашиванию третьей дорожки, мкг.

Гидро-. фобность, мкг

ДДС-Na на

100 мкг белка

Нпощадь пиков, (в ариант б), ДДС-Na связанHbIH белком, мкг

Площадь пиков по ва2 риантам, мм

Группа компонентов елок, мкг б а-б

А:

165 128 37 0,005 240 . 29 0,02

995 510 485 0,140 928 143 0,12

618 254 364

120 88 32

0 120 672 81 0 )5

0,004 70 8 0,05

Составитель А. Семенов

Техред А.Кравчук

Корректор М.Демчик

Редактор Л, Веселовская

Заказ 7073/42 Тир аж .788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород ° ул. Проектная, 4

Формула изобретения

Способ определения гидрофобности белков, включающий обработку анализируемых белков додецилсульфатом натрия и связывание метиленового голубого, отличающийся тем, что, с целью усиления разрешаю-. щей способности и повышения точности анализа, анапизируемые белки предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в трех параллельных дорожках, денатурируют три-." хпоруксусной кислотой и первую дорожку инкубируют в 0,14-0,20 мМ растворе додецилсульфата натрия, освобождают гель от избытка детергента фосфатным буфером рН 7,0 и окрашивают 0,0020,004%-ным раствором метиленового голубого, вторую дорожку окрашивают

0,002-0,004%-ным раствором метиленового голубого, третью окрашивают

99

0,05%-ным раствором кумасси R-250 и после освобождения гелей от избытка красителей дистиллированной водой интенсивность окраски белков измеряют денситометрированием и по разности оптических плотностей первых двух дорожек судят о количестве связавшегося додецилсульфата натрия с белковой зоной, а по оптической плотности третьей дорожки находят количество белка с последукщим расчетом количест- ва додецилсульфата натрия.,на единйцу белка согласно формуле