Способ оценки селекционного материала кукурузы на выявление гена опейк-2

 

Изобретение относится к биотехнологии ,в частности, к селекционно-генетическим исследованиям сельскохозяйственных культур, и может быть широко применено при массовой оценке селекционного материала на наличие мутантного гена Опейк-2. Целью изобретения является повышение точности диагностики, а также обеспечение сохранности зернового селекционного материала. Способ заключается в том, что ген Опейк-2 выявляют по пониженной активности аспартатаминотрансферазы в листьях, отобранных после опыления, причем экстракцию альбумина проводят после удаления из образца хлорофилла. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) (И) А1 (594 А 0

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,К СВИДЕТЕЛЬСТВУ трансферазы в белковом экстракте листьев исходной и мутанной кукурузы без предварительной экстракции хлорофилла, в табл. 2 — данные по определению активности АСТ-азы в белковык экстрактах листьев исходной и мутантной кукурузы линий wf 9 по фазам созревания зерна после удаления иэ листьев хлорофилла; в табл, 3данные по определению активности

АСТ-азы в белковых экстрактах листьев исходной и мутантной кукурузы ли :ний А 204 по фазам созревания зерна в разные годы полевого опыта.

Способ осуществляют следующим образом, Навеску размолотых свежих или лиофильно высушенных листьев заливают охяажденным ацетоном в соотношении

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

flPH ГННТ СССР (21) 4265412/31-13 (22) 18. 06.87 (46) 15.04.89, Бюл. N 14 (71) Днепропетровский государственный университет им. 300-летия воссоединения Украины с Россией (72) Н.А. Винниченко, Н.П. Коцюбинская, lo.Â. Донченко, Н.Г. Зинченко и В.С. Бильчук (53) 575.22:633.523(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

В 138 1160, кл. А 01 Н 1/06, 10. 06. 86. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СЕЛЕКЦИОННОГО

МАТЕРИАЛА КУКУРУЗЫ НА ВЫЯВЛЕНИЕ .

ГЕНА ОПЕЙК-2 (57) Изобретение относится к -биоИзобретение относится к биотехно-; логии, в частности K селекционногенетическим исследованиям сельскохозяйственных культур, и может быть применено при массовой оценке селекционного материала на наличие мутантного гена Опейк-2.

Цель изобретения — повьппение точ1 ности диагностики и сохранение зернового селекционного материала. Способ состоит в том, что ген

Опейк-2 выявляют по пониженной активности аспартатаминотрансферазы в листьях, отобранных после опыления, .причем экстракцию.альбумина проводят после удаления из образца хлорофил- ла °

В табл. 1 приведены данные пооп.-. ределению активности аспартатамино» технологии, в частности к селекционно-генетическим исследованиям сельскохозяйственных культур, и может быть широко применено при массовой оценке селекционного материала на наличие мутантного гена Опейк-2, Цель изобретения — повышение точности диагностики, а также обеспечение сохранности зернового селекционного материала. Способ заключается в том, что ген Опейк-2 выявляют.по пониженной активности аспартатаминотрансферазы в листьях, отобранных после опыления, причем экстракцию альбуми" на проводят после удапения из образца-хпорофилла. 4 табл. g

1472000

5 е

20

1: 10 и выдерживают в течение 30 мин.

Пробы центрифугируют. Супернатант отбрасывают.. Операцию проводят дважды. Из осадка выделяют экстракт белков дистиллированной водой при 0-4 С

Экстракт отделяют от механических примесей центрифугированием. В пробирки вносят по 1 мл предварительно приготовленного субстрата АСТ и

0,2 мп кукурузного экстракта. Пробы инкубируют при 37 С 60 мин, добавляют 1 мл 1 мМ 2,4-динитрофенилгидразина, через 10 мин — 10 мп 0,4 M

Na0H и оставляют на 10 мин, затем измеряют оптическую плотность опытного образца на фотокалориметре или спектрофотометре при длине волны

500-560 нм. Контрольный образец об рабатывают аналогично опытному, од нако экстракт из зерна кукурузы добавляют после инкубации. Определение активности АСТ-азы проводят парал лельно в исходной и мутантной форме кукурузы. По пониженной активности аспартатаминотрансферазы судят о .наличии гена Опейк-2 в генотипе кукурузы.

Субстрат для определения активности АСТ-аэы готовят следующим образом.

30 r oC -кетоглутаровой кислоты и 2,7 r DL-аспарагиновой кислоты растворяют в 1 н. растворе NaOH до рН 7,4, затем 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4 доводят объем раствора субстрата до 100 мп. Хранят в замо роженном виде.

Дня построения калибровочной кривой навеску 10 мл пирувата натрия растворяют в 100 мл дистиллированной, воды, В пробирки наливают соответственно по О, 1; 0,2 0,3; 0,4; 0,5 и 0,6 мп стандартного раствора и добавляют в них дистиллированную воду до 0,6 мл, что соответствует 10; 20;

30; 40; 50 и 60 мкг пирувата натрия в каждой пробе. Затем в пробирки добавляют 0,5 мл 2,4-динитрофеннлгидразина и через 10 мин 5 мл 0,4 M

ИаОН. По истечении 10 мин измеряют оптическую плотность проб при 500560 нм. Контроль содержит 0,6 мл воды вместо пирувата натрия.

Для оценки селекционного материала анализируют листья исходных и . мутантных линий кукурузы.

Пример 1. 1 r листьев кукурузы измельчают и запивают 5 мл дистиллированной воды при 0-4 С. Экст-, ракцию белков проводят в течение 1 ч.

Экстракт отделяют центрифугированием.

В пробирки вносят по 1 мл субстрата

АСТ и 0,2 мл экстракта листьев и проводят определение активности АСТ-азы.

Различия в активности АСТ-азы между исходной и мутантной кукурузой нивелируются за счет того, что на окраску проб, обусловленную активностью фермента, влияет окраска экстракта листьев в связи с присутствием хлорофилла.

Пример 2, 1 г листьев кукурузы +4+vf 9 и 0 0 0 vf 9, отобранных в разные фазы развития, измельчают, заливают охлажденным ацетоном в соотношении 1: 10 и выдерживают в течение 30 мин. Пробы центрифугируют, супернатант отбрасывают.

Операцию проводят дважды. К осадку добавляют 5 мл дистиплированной воо ды при 0-4 С. Экстракцию белков проводят в течение 1 ч. Экстракт отделяют центрифугированием. В пробирки вносят по 1 мл субстрата АСТ и 0,2 мп экстракта листьев и проводят определение активности АСТ-азы.

Установлено, что введение мутантного гена в генотип линии мй9 вызвало снижение активности АСТ-азы в листьях. Активность АСТ-азы в листь-. ях мутантной линии составляет 61-84Х от активности фермента .в листьях исходной формы кукурузы, что обусловлено более интенсивным оттоком АСТ-азы из листьев мутантной кукурузы в зерно, где ее активность повышена по сравнению с нормальным генотипом.

Пример 3. Обработку листьев проводят аналогично примеру 2 с линиями кукурузы +++ А 204 и 0 0 0

А 204, отобранных s разные фазы со-оо зревания зерна в 1985 и в 1986 гг.

Активность фермента у мутантного генотипа во все сроки исследований составляет 63-83Х по. отношению к исходному. Абсолютные величины активности фермента изменяются в разные фазы развития, а также зависят от погодных условий года проведения селекционно-генетических исследований.

Однако сравнительный анализ исходного и мутантного генотипов линий

А 204 в одни и те же фазы развития показывает сохранение установленной закономерности пониженной активности фермента в линии Опейк-2.

5 14

Пример 4. Обработку листьев проводят аналогично примеру 2 с линиями кукурузы +++ А 204; О 0 0

А 204; +++wf9, 0 0 0 юЕ9, отобранными в разные сроки вегетации 1986 г. до опыления початков (см,табл.4), 72000 тов кукурузы с улучшенным качеством белка, а пониженная активность АСТ« аэы в листьях может явиться одним иэ перспективных тестов при создании новых форм кукурузы.

Формула изобретения

Различия между исходной и мутантной кукурузой по активности аспартатаминотрансферазы B листьях, отобранных до опыления предлагаемым способом, не выявлены. Установленная закономерность — пониженная активность АСТ-азы в листьях мутантной кукурузы — наблюдалась только в пробах, отобранных после опыления кукурузы, т.е. в период созревания зерна.

Очевидно, укаэанные различия по активности фермента в листьях, отобранных после опыления, обусловлены различной спецификой динамики накопленйя белка в зерне мутантной кукурузы по отношению к исходной.

Предлагаемый способ может найти широкое применение при проведении массовых селекционно-генетических исследований по созданию новых мутанСпособ оценки селекционного материала кукурузы на выявление гена

Опейк-2, предусматривающий обработку размолотого растительного образ-. ца экстрагентами с получением белко16 вой фракции, включающий альбумин, очистку от механических примесей и последующее выявление гена Опейк-2 по активности аспартатаминотрансферазы при длине волны 500-560 нм, 2р отличающийся тем, что, с целью повышения точности диагностики и сохранения селекционного зерно-.. вого материала, ген Опейк-2 выявляют ио пониженной активности аспартат25 аминотрансферазы в листьях, отобранных после опыления, причем экстракцию альбумина проводят после удаления из образца хлорофилла.

Таблица

Фаза созревания зерна

Линия кукурузы

I и

+++ wf 9

0 0 0 яй 9

+++ А 204

О О О А 204

23,91

22,74

26,49

25,73

Формирование зерна

Иолочная спелость

Таблица 2

Активность фермента мутантного reельная активность АСТ-азы, ед/мг белка Разность активности между исходным и мутантным генотипом нотипа к исходному, Х енотип ликии

0 О ттЕ 9

32 6

25,0

24 ° 89

61

73

14,61

6,59

3,94

19,99

18,31

20,96

Формирование

Налив

Иолочная спелость Молочно-восковая спелость

Восковая спелость

21,49

21,86

27,02

29,03

5,53

7,71

Фаза созревания зерна

Удельная активность АСТ-аэы, ед!мг белка

1472000

Таблица 3

Удельная активность АСТ-азы, ед/мг белка, Фаза созревания зерна

Генотип линии

0 0 0з А 204

f985 1986

1985 1986

1985 1986

25,5 .. 29 ?3

29,30 . 33 34

32,14 34,38

24,70

20,92

24,64

82 83

74 83

77 72

21,0

21, 72

24,72

32,18 43,92

26,62 37 91

27,30 36,84

25, 13

18,47

26, 74

33,33

26,46

29,71

78 76

69 70

72 81

Таблица 4

Удельная активность АСТ-азы, ед/мг белка

Дата отбора проб листьев до опыления

Генотип линии А 204

+ 0 О 0

Генотип линии wf9

+++ 0 0 0

3 июня

25 июня

? июля

10,31

15,30

21,90

11,34

14,52

20,00

8,51

12, 00

f5,10

Составитель В. Демкин

Техред Л.Олийнык едактор И. Петрова

Корректор С. Патрушева

Заказ 1639/3 Тираж 618 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский, комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина, 101

Формирование

Налив

Молочная спелость

Молочно-восковая спелость

Восковая спелость

Полная спелость

ВЩ

8,33

14, 15

Активность фермента мутантного генотипа к исходному, Й