Способ отбора мутантов бактерий, неспособных к синтезу нуклеаз

 

Изобретение относится к способам отбора мутантов микроорганизмов и может быть применено в микробиологии, генетике, биотехнологии и биохимии. С целью повышения чувствительности способа отбора мутантов бактерий ESCHERICHIA COLI и SERRATIA MARCESCEUS, не способных к синтезу нуклеаз, обработанные мутагеном культуры выращивают на индикаторной среде в течение 18-24 ч при 37°С, содержащей нуклеиновую кислоту и толуидиновый синий, после этого выросшие колонии обрабатывают хлороформом в течение 3-5 мин, удаляют хлороформ и инкубируют культуры дополнительно в течение 18-24 ч при той же температуре, затем регистрируют наличие розовых зон гидролиза ДНК под действием внутриклеточных нуклеаз. Возможность определения секретируемых и внутриклеточных нуклеаз повышает чувствительность способа отбора мутантов, не способных к синтезу этих ферментов.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) SU (ш (gD 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТ =Т

ll0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Н А STOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4281706/31-13 (22) 10.07.87 (46) 23.07.89. Бюл. 11 27 (71) МГУ им, М, В. Ломоносова (72) В. В. Грошев, Л. Г. Шахнабатян и С. B. Шестаков (53) 577.15(088.8) (56) Jeffries С. D. Holtman D. F.

Guse D. Т. Rapid method for determining the activity of microorganisms

on nucleic acids. — J. Bacteriol, 1957, ч, 73, Р 4, р. 590-591.

Schreier J. В. Modification of

deoxyribonucleaså test medium for

rapid identification of Serrotia

marcescens. — American 3. Clinical

pathology, В.S ° MT (ASSP) !969,ч.51, У 6, р. 711-716. (54) СПОСОБ ОТБОРА МУТАНТОВ БАКТЕРИЙ, НЕ СПОСОБНЫХ К СИНТЕЗУ НУКЛЕАЗ (57) Изобретение относится к способам отбора мутантов микроорганизмов и моИзобретение относится к способам отбора мутантов микроорганизмов, не способных к синтезу биологически ак- тивных веществ, и может быть применено в микробиологии, генетике, биотехнологии, биохимии.

Подобные мутанты могут быть продуцентами ценных ферментов, например, рестриктаз и не должны при этом обладать примесными нуклеазами.

Цель изобретения — повьппение чувствительности способа отбора мутантов.

Способ заключается в том, что . культуры бактерий обрабатывают мута-

2 жет быть применено в микробиологии, генетике, биотехнологии и биохимии.

С целью повышения чувствительности способа отбора мутантов бактерий

Escherichia coli u Serratia marcescens, не способных к синтезу нуклеаз, обработанные мутагеном культуры выращивают на индикаторной среде в течение 18-24 ч при 37 С, содержащей нуклеиновую кислоту и толуидиновый синий. После этого выросшие колонии обрабатывают хлороформом в течение

3-5 мин, удаляют хлороформ и инкубируют культуры дополнительно в течение

18-24 ч при той же температуре, затем регистрируют наличие розовых зон гидролиза ДНК под действием внутри— клеточных нуклеаз. Возможность определения секретируемых и внутриклеточных нуклеаз повышает чувствительность способа отбора мутантов, не способных к синтезу этих ферментов. геном и культивируют на твердой индикаторной среде, содержащей нуклеиновув кислоту и краситель — толуидиновый синий, в течение 18 ч при 37 С и регистрируют розовые зоны гидролиза ДНК под действием секретируемых нуклеаз, после чего выросшие колонии обрабатывают хлороформом в течение 35 мин, удаляют хлороформ и инкубируютдополнительно в течение 18-24 ч при той же температуре, затем регистрируют наличие розовых зон гидролиза ДНК под действием внутриклеточных нуклеаз. индикаторную среду, соответствующую среде в примере 1, и инкубируют 20 ч при 32 С, Поверхность твердой среды заливают хлороформом и инкубируют

3 мин при комнатной температуре. Хлороформ сливают, чашки подсушивают и инкубируют дополнительно 18 ч при о

32 С. Регистрируют увеличение зон гидролиза ДНК вокруг колоний, клеток

Serratia marcescens, секретирувщих нуклеазы. Вокруг колоний мутантов, дефектных по синтезу секретируемых нуклеаз, розовые зоны не регистрируются или они.значительно меньше по размеру. Колонии мутантов отсевавт на полнув среду.

Вокруг штрихов 4, 5, б клеток различных штаммов Е. coli (К12сР63, К12 НВ101, В), синтезирующих нуклеазы, отсутствуют зоны гидролиза ДНК. ,Обработка штрихов клеток хлороформом вызывает высвобождение нуклеаз в

3 1495379

Используемый в предлагаемом способе мутаген . — N-метил-N --нитро-N-нитрозогуанидин может быть заменен мутагеном любого типа.

Штаммы исходных культур Е. coli

1312, 151, 1182, Е. coli К12 сР63, - Kl 2 НВ101 и Е. coli В, а также исходный штамм S. marcescens дикого типа хранятся в коллекции на кафедре гене- 10 тики и селекции Биологического факультета ИГУ.

Пример 1. Обработанные

/ мутагеном N-метил-N-нитро-N-нитроз огуанидином клетки Е. coli высевают на индикаторнув среду, содержащую, г/л: толуидиновый синий 0,16; NaC1

5,0; ДНК 0,3; трис- 6,05; бактотриптон 5,0; дрожжевой экстракт 3,0;

4gS04 х 7Н О 2,46", глюкоза 4,01 агар 20

"Дифко" (Noble) 15,0, рН 7,6-7,8, и инкубируют 18 ч при 37 С. Поверхность твердой среды заливают хлороформом и инкубируют 3 мин. Хлороформы сливают, чашки подсушивают до полного удаления 25 хлороформа в приоткрытом виде 5 мин и и затем инкубирувт дополнительно 18 ч при 37 С. Регистрируют вокруг колоний клеток, синтезирующих дезоксирибонуклеазы, розовые зоны на темно- 30 синем фоне индикаторной среды. Вокруг колоний клеток мутантов, дефектных по синтезу этих ферментов, розовые зоны не регистрируются или значительно меньше по размеру. Колонии мутантов отсевавт на полную среду.

Пример 2. Обработанные .мутагеном, указанным в примере 1, клетки Е. coli высевают на индикаторную среду, соответствувщую среде, описан- 40 ной в примере 1. Поверхность твердой среды заливают хлороформом и инкубирувт 5 мин. Хлороформ сливают, чашки подсушивают до полного удаления хлороформа, затем инкубируют 24 ч при 45

37 С. Регистрирувт вокруг колоний клеток, синтезирующих дезоксирибонуклеазы, розовые зоны на темно-синем фоне индикаторной среды. Вокруг колоний клеток мутантов, дефектных по .синтезу этих ферментов, розовые зоны

-не регистрируются или значительно меньше по размеру. Колонии мутантов отсевают на полную среду.

Пример 3, Обработанные мутагеном, указанным в примере I клетки E. coli высевавт на индикаторнук среду, соответствующую среде, приведенной в примере 1, и инкубируит

28 ч при 37 С. Колонии обрабатывают хлороформом и инкубирувт 8 мин. Хлороформ сливают, чашки подсушивают до полного удаления хлороформа и инкубируют 28 ч при 37 С. Регистрируют

1 розовые зоны BQKpyr колоний микроорганизмов, однако отбор жизнеспособных клеток колоний невозможен из-за гибели клеток.

Пример 4. Обработанные мутагеном, указанным в примере 1, клетки Е. coli высевают на индикаторную среду, соответствующую среде, приведенной в примере 1, и инкубируют 16 ч о при 37 С. Колонии обрабатывавт хлороформом и инкубируит 1 мин. Хлороформ сливают, чашки подсушивают до полного удаления хлороформа и инкубирувт

16 ч при 37 С. Розовые зоны вокруг колоний клеток, синтезирующих дезоксирибонуклеазы, практически отсутствуют, что делает невозможным отбор мутантов, неспособных к синтезу дезоксирибонуклеаз.

Пример 5. Обработанные названным в примере 1 мутагеном клетки

Е. coli высевают на индикаторную среду, соответствующую среде, приведенной в примере 1, и инкубируит 18 ч при 29 С,.Рост бактерий практически отсутствует, вследствие этого последующая обработка хлороформа невозможна.

Пример б. Обработанные мутагеном, указанным в примере 1, клетки Serratia marcescens высевают на

Составитель В. Соина

Редактор Н. Гунько Техред:А.Кравчук Корректор О. Кравцова

Заказ 4217/2б

Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 1495379 6 среду и образование зон гидролиза. тем обработки исходных культур мутаЗоны гидролиза отсутствуют вокруг . геном и последующего культивирования штрихов 1, 2, 3 клеток мутантов Е. со- клеток на индикаторной среде в течеli К12 (1312, 1511, 1182), дефектных ние 18-24 ч при 37 С, содержащей испо эндонуклеазе 1, независимо от об- точники роста, нуклеиновую кислоту и работки хлороформом. толуидиновый сииии и регистрацией

Использование хлороформа для об- розовых зон гидролиза нуклеиновой работки клеток, выращенных на инди- кислоты вокруг колоний, о т л и— каторной среде, позволяет одновремен- 10 ч а ю шийся тем, что, с целью но определять внутриклеточные и сек- .повышения чувствительности способа, ретируемые бактериями нуклеазы, что выросшие на индикаторной среде колоповышает чувствительность способа от- нии обрабатывают хлороформом в течебора мутантов, не способных к синтезу ние от 3 до 5 мин с поспедующим его нуклеаз. удалением и дополнительно инкубируют

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я колонии до появления эон гидролиза

Способ отбора мутантов бактерий, нуклеиновой кислоты под действием .не способных к синтезу нуклеаз, пу- внут рикле точных нукле аз .