Способ получения жизнеспособных поздних бластоцист лошадей in viтrо

 

Изобретение относится к эмбриотехнологии, а точнее к способам культивирования эмбрионов лошадей. Целью изобретения является обеспечение нормального роста и развития поздних бластоцист лошади IN VITRO и разработка способа оценки их жизнеспособности. Для этого бластоцисты после извлечения и оценки помещают на 12 - 24 ч в культуральную среду, содержащую желток диетического куриного яйца, фосфатно-солевой буферный раствор Дюльбекко (ФБС Дюльбекко) и/или стерилизованное кобылье молоко , и культивируют в обычной газовой атмосфере. При остальных равных условиях наилучший результат получается при культивировании бластоцист в среде, содержащей, мас.%: желток 40

ФБС Дюльбекко 20

молоко 40 . Жизнеспособность эмбрионов определяют визуально по месту их расположения в толще жидкости. 3 з.п. ф-лы, 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (gi) 4 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П.(НТ СССР (21) 4327730/30-13 (22) 12.11.87 (46) 30.07.89. Бюл. Р 28 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт коневодства (72) С.Г. Лебедев и Л.Ф. Лебедева (53) 578.085.23(088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ

ПОЗДНИХ БЛАСТОЦИСТ ЛОНАДЕИ IN UITRO (57) Изобретение относится к эмбрио технологии, а точнее к способам культивирования эмбрионов лошадей. Целью изобретения является обеспечения нормального роста и развития поздних бластоцист лошади in vitro и разработка способа оценки их жизнеспособИзобретение относится к эмбриотехнологии, а именно к способам культивирования эмбрионов лошадей.

Цель изобретения — получение жизнеспособных поздних бластоцист лошадей .in vitro, Поставленная цель достигается тем, что эмбрионы после извлечения помещают в питательную среду, инкубируют в термостате в течение 1224 ч, а затем отбирают бластоцисты с поверхности питательной среды, содержащей желток куриного яйца и фосфатно-солевый буфер Дюльбекко и/или кобылье молоко при следующем соотношении компонентов: желток куриного яйца: фосфатно-солевый буфер Дюльбекко (1-3):(2-4); желток куриного яйца: кобылье молоко (1-4):(1-4), желток куриного яйца . фосфатно-солевый буфер Дюльбекко: кобылье молоко (1-3):(1 3):(1-3) .

„„SU„„1497215

2 ности. Для этого бластоцисты после извлечения и оценки помещают на 1224 ч в культуральную среду, содержащую желток диетического куриного яйца, фосфатно-солевой буферный раствор Дюльбекко (ФБС Дюльбекко) и/или стерилизованное кобылье молоко, и культивируют в обычной газовой атмосфере. При остальных равных условиях, наилучший результат получается при культивировании бластоцист в среде, содержащей, мас.Х: желток 40, ФБС Дюльбекко 20, молоко 40. Жизнеспособность эмбрионов определяют визуально по месту их расположения в толще жидкости.

3 з.п. ф-лы, 3 табл.

Для определения оптимальных соотношений вводимых в среду компонентов используют принцип треугольной трехкомпонентной диаграммы Гиббса-Роэебома. В одной серии опытов готовят 21 вариант среды с 20Х-ным интервалом ,концентрации базового раствора, желтка. и молока. Всего проводят 2 серии опытов. В первой серии опытов .зародыши культивируют в течение

12 ч, а во второй в течение 24 ч.

Способ осуществляют следующим образом.

В стерильный флакон последовательно добавляют желток куриного яйца, ФБС Дюльбекко и/или кобылье молоко в указанных соотношениях.

Компоненты осторожно перемешивают, не допуская образования пены, до получения однородной смеси. Флакон со средой помещают в термостат для подогрева до оптимальной температу50

3. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что желток куриного яйца и кобылье молоко берут в соотношении (1:4)-(1:4).

3 149721 ры. Извлеченный 8-дневный эмбрион лошади пипеткой переносят в культуральную среду и инкубируют при 37 С, До и после культивирования проводят оценку и измерение эмбрионов под микроскопом ИСБ-9.

Интенсивность роста бластоцист в среде, состоящей из желтка куриного яйца и ФБС Дюльбекко в соотношениях 1р (1-3):(2-4), приведены в табл. 1.

Наилучший результат получен при культивировании в среде 3 (6 мл желтка и 4 мл ФЭБ Дюльбекко).

Интенсивность роста бластоцист в 15 среде, состоящей из желтка куриного яйца и кобыльего молока в соотношениях (1-4):(1-4), приведено в табл. 2.

Стабильный рост бластоцист наблюдают в среде 8, содержащей 4 мл желтка куриного яйца и 6 мл стерильного кобыльего молока.

Интенсивность роста бластоцист в среде, содержащей желток куриного яйца, ФБС Дюльбекко и кобылье молоко в соотношениях (1:3):(1:3):(1:3) и приведена в табл. 3.

Анализ результатов культивирования показывает, что бластоцисты развивают- 3р ся как йри 12-часовом, так и при 24-часо вом культивировании, причем рост является стабильным. Наилучшие результаты получают при культивировании эмбрионов в среде 14, которая содержит

4 мл желтка куриного яйца 2 мл ФБС

Дюльбекко и 4 мл стерилизованного кобыльего молока.

Таким образом, устанавливают, что восьмисуточные лощадиные эмбрионы в период 12-24 часового пребывания в культуральных средах, состоящих из смеси желтка с кобыльим молоком и/или. фосфатно-солевым буферным раствором Дюльбекко, продолжают интенсивно увеличиваться в размерах. При 45 просмотре под микроскопом у большинства прокультивированных в этих средах зародышей не отмечают каких-либо отклонений от нормы. Клетки трофобласта и эмбриобласта четко выражены, зародыш полупрозрачен, правильной шаровидной формы. Эмбрионы, помещенные на 12-24 ч в чистый желток или фосфатно-солевый буферный раствор Дюльбекко, не растут. При осмотре под микроскопом у них обнаруживают признаки дегенерации: клетки трофобласта сморщиваются и сжимаются в плотный помутневший комок, оболоч5 4 ка-бластолемма резко отделяется от клеточной массы по всему периметру, Часть помещенных в чистое кобылье молоко либо смесь кобыльего молока с фосфатно-солевым буферным раствором

Дюльбекко эмбрионов увеличивается в размерах незначительно. Эти зародыши, как правило, сохраняют нормальную клеточную структуру, полупрозрачны, но у них по периметру просматриваются участки с частично отделенной от клеточной массы оболочкой-бластолеммой.

Во время проведения опытов неожиданно обнаружено, чем эмбрионы с нормальной клеточной структурой, помещенные в среды 2-4, 7-9, 11-16, всплывают к поверхности жидкости и приближаются к стенкам стеклянного сосуда, где могут быть легко обнаружены визуально. Эмбрионы с нарушенной клеточной структурой постепенно погружаются в толщу жидкости. Кроме того, плавающие у поверхности бластоцисты за период культивирования существенно увеличиваются в размерах. Опустившиеся в толщу жидкости зародыши не растут.

Клеточная структура плавающих после культивирования у поверхности зародышей не отличается от нормы.

Опустившиеся в толщу эмбрионы всегда имеют сморщенные и спавшие клетки трофо- и эмбриобласта и отслоенную оболочку бластолемму.

Формула изобретения

1. Способ получения жизнеспособных поздних бластоцист лошадей

in vitro включающий извлечение эмбрионов, помещение их в питательную среду, содержащую желток куриного яйца и фосфатно-солевой буфер

Дюльбекко и/или кобылье молоко, с последующей инкубацией в термостате в течение 12-24 ч и отбором бластоцист с поверхности питательной среды.

2. Способ по и. 1, отличаюшийся тем, что желток куриного яйца и фосфатно-солевой буфер

Дюльбекко берут в соотношении (1-3):

:(2-4).

1497215 6 бекко и кобылье молоко берут в соотношении (1-3): (1-3): (1-3) .

4. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что желток куриного яйца, фосфатно-солевой буфер ДюльТ а б л и ц а 1

Соотношение ингредиентов в среде, мл

Увеличение объема бластоцист, I к начальному объему

Среда при 24-часовом культивировании при 12-часовом культивировании

Желток ФБС Дюльбекко

610,4

1005,0

324,3

Таблица 2

Увеличение объема бластоцист, 7. к начальному объему

Соотношение ингредиентов в среде, мл

Среда при 12-часовом при 24-часовом культивировании культивировании

Молоко

Желток

2

6

6

8

10

368, 1

773,9

232,8

Таблица 3

Увеличение объема бластоцист, 7. к начальному объему

Соотношение ингредиентов в среде, мл

Среда при 24-часовом культивировании при 12-часовом культивировании

Желток

Молоко

11

12

13

14

Составитель И.Тареева

Техред М.Ходанич

Редактор Н.Киштулинец

Корректор С.Черни

Заказ 4406/29 Тираж 501 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул. Гагарина, 101

2

4

2

4

2

4

2

6

4

4

Ь

6

2

2

336, 7

425,9

305,7

429,9

176,1

340,4

304,9

490,9

398,9

275,0

125,8

413,9

133,2

116,7

442,2

709, 7

62Ь, 7

844, 5

864,2

767,8