Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектный по тимидинкиназе для гибридизации и трансфекции

 

Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является получение штамма культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектного по ферменту тимидинкиназа, что необходимо для расширения спектра клеток, пригодных для гибридизации и трансфекции. Достигается это селекцией дефектных по ферменту тимидинкиназа клеток из популяции перевиваемой линии PZC/PRF - 5 путем многоступенчатого отбора с помощью 5-бром-2-дезоксиуридина. Полученный штамм может быть использован при гибрифизации соматических клеток, а также для трансференции рекомбинантной ДНК.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

t (5g 4 С 12 N 5/00, 5/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и Д ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4339112/31-13 (22) 05, 11.87 (46) 23.07.89. Бюл. Р 27 (71) Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского (72) Ш.М.Тугизов и А.А.Кущ (53) 578.085.23 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 1275905, кл. С 12 М 5/00, 08,08.86.

Цигология. 1985, т. 27, Р 2, с. 221-228. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ГЕПАТОКАРЦИНОМЫ ЧЕЛОВЕКА, ДЕФЕКТНЫЙ ПО

ТИМИДИНКИНАЗЕ ДЛЯ ГИБРИДИЗАЦИИ И

ТРАНСФЕКЦИИ

Изобретение относится к биотехнологии, Целью изобретения является получение штамма культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектного по ферменту тимидинкиназа, что необходимо для расширения спектра клеток, пригодных для гибридизации и трансфекции.

Пример 1. Культивирование штамма BCKK(II) 11 82Д. г

Клетки мутантного штамма культивируют в среде Игла МЕМ, содержащей

10-153 сыворотки эмбриона коровы или бычьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 1520 мМ НЕРЕЯ, 30-50 мкг/мл ентамицина, при 37 С в стационарных условиях. о

При посеве 1-2 10 кл/мл через 35

5 сут формируется монослой. Клетки

„„SU„„ i 495375 А 1 (57) Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является получение штамма культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектного по ферменту тимидинкинаэа, что необходимо для расширения спектра клеток, пригодных для гибридизации и трансфекции. Достигается это селекцией дефектных по ферменту тимидинкинаэа клеток из популяцпи перевиваемой линии РЕС/PRF--5 путем многоступенчатого отбора с помощью 5-бром2-деэоксиуридина. Полученный штамм может быть использован при гибрифизации соматических клеток, а также для трансфекции рекомбинантной ДНК. снимают с помощью растворов 0 257.— о ного трипсина и 0,027.-ного. версена в соотношении 1:9-1:10. Кратность рассева 1:3-1:5. Необходимо регулярно (через 2-4 мес культивирования) про- Q3 водить в присутствии 20 мкг/мл S-БДУ („@ для предотвращения образования ревер- а Я тантов. СЛ

Пример 2. Реверсивный анализ штамма BCKK(II) N - 82Д.

Для проведения реверсионного анаI лиза мутантного штамма клетки высевают в количестве 2-3 ° 10 кл/см . Через

2 сут ростовую среду заменяют на среду

Игла МЕМ, содержащую 100 мкг/мл этилметансульфоната. Клетки инкубируют с мутагеном 18-20 ч и после этого культивируют в течение 7-10 дней (обычно

2-3 пассажа). Клетки, обработанные

3 149537 мутагеном, высевают по 1-2 i 10 кл/см в ростовую среду, содержащую гипоксантин (13,6 мкг/мл), аминоптерин (0,5 мкг/мл) и тимидин (30 MKr/мл).

Смену среды проводят через каждые 34 дня. На 12-14-й день культивирования клетки фиксируют с помощью 707. этанола и окрашивают 1Х-ным раствором красителя Унна. 1О

Подсчет колоний (ревертантов) проводят визуально и путем микроскопирования (об 10, ок 7). Исследуют 1,2" ь 10 кл., среди них ревертанты не обнаруживают. fS

Пример 3. Использование штам ма для BCKK(II) й"" 82 гибридизации соматических клеток.

В качестве второго партнера по слиянию используют клетки перевивае- 20 мой линии плазмицитомы мьппей NS-О, дефектные по ферменту гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансфераза (ГФРТ).

Эти клетки, растущие в суспензии, также, как и клетки PLC/PRF-5-С4-ТК, 25 не способны размножаться в среде

ГАТ. Клетки обоих родительских партнеров подготавливают к слиянию: снимают клетки на вторые сутки культивирования, дважды отмывают от сыво- ЗО ротки центрифугированием (1000 об/мин в течение 10 мин) в среде Игла MEM.

Подсчитывают количество жизнеспособных клеток и смешивают клетки обеих родительских линий в соотношении 1:5 (клетки PLC/PRF-5С4-ТК : NS-О). После совместного центрифугирования (1000 об/мин в течение 10 мин) надосадочную жидкость отсасывают, оставляя не более 50 мкл. Осадок разбива-,40

It ют поколачиванием по дну центрифужной пробирки. К осадку сразу же добавляют 0,5 мл 50 .-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с мол. массой

1550 и осторожно ресуспендируют клет- 45 ки пипеткой. Клетки выдерживают 1 мин без перемешивания, затем раствор ПЭГ быстро разводят, добавляя 10 мл среды без сыворотки.

Суспензию клеток распределяют в

4 чашки Петри по 2 10 кл/см . Через

30 мин осторожно отсасывают культуральную жидкость и, добавляют ростовую среду, содержащую ЗХ сыворотки . эмбриона коровы. Клетки инкубируют при 37 С в атмосфере 7,5% СО>, Через

24 ч среду заменяют на новую, содер- жащую 10 сыворотки эмбриона коровы.

Еще через 24 ч клетки снимают: расту- .

5 4 щие в суспензии — путем встряхивания, а прикрепленные к субстрату — с помощью раствора версена с трипсином.

Клетки высевают по 1 10 кл/см селективную среду ГАТ (гипоксантин

13,6 мкг/мл, аминоптерин 0,5 мкг/мл, тимидин 30 MKr/мл). Смену среды проводят через каждые 2-3 дня. Через

10-14 сут после слияния обнаруживают гибридные колонии. Клонирование проводят с использованием металлических цилиндров. Клонированные гибридные клетки культивируют в ростовой среде, содержащей 13,6 мкг/мл гипоксантина, 15 мкг/мл тимидина, 5 мкг/мл глицина., до получения массовых культур (обычно 7-10 дней).

Пример 4. Использование штамма BCKK(II) 9 82 для трансфекции

ДНК плазмидой, содержащей ген ТК вируса простого герпеса I (ВПГ-1), Для трансфекпии используют очищенную ДНК плазмиды pFF, несущую ген

ТК ВПГ-1. Клетки высевают за один день до опыта по 1,5 10 кл/см в ф среду Игла MEN содержащую 10Х диализованной сыворотки эмбриона коровы.

Диализ сыворотки проводят против

РВБ(0,01 М NBC1 0,1 N МаН РО4, 0,01

М NaHPO, рН 7,2) при +4 С в течение

48 ч. ДНК плазмиды стерилизуют путем переосаждения 80 -ным зтанолом и 1растворяют в стерильном буфере В (О., 1 мМ ЭДТА — 1 мМ трис-НС1, рН 9).

К стерильному раствору ДНК в буфере

В добавляют раствор СаС1 (2М) до конечной концентрации 250 мМ. Раствор ДНК в 250 мМ СаС1 добавляют по каплям к равному объему двухкратного буфера А (275 мМ, 10 мМ КС1 10 мМ глюкозы, 1,5 мМ Na HPOg 40 мМ HEPES, рН 7,05) и инкубируют 40 мин при +4©С.

Концентрация ДНК должна составлять .

1 мкг на 10 клеток, высеянных в чашки Петри диаметром 60 мм.

В качестве ДНК-носителя используют высокомолекулярную ДНК спермы лосося

6 концентрации 30 мкг на 10 кл.

Среду из чашки сливают, клетки промывают PBS (рН 7,2), добавляют преципитат ДНК-фосфат кальция (1,5 мл на чашку) и инкубируют 2,5-3 ч при

37 С в атмосфере 7,5 . СО . Затем клетки промывают средой без сыворотки и заливают среду Игла 5КМ содержащую

З . сыворотки эмбриона коровы, диализованной против PBS (pH 7,2) . Спус1495375 формула изобретения

Диагностический набор (производ; ства Горьковского НИИЭМ) представляет

Составитель С.Светлышев

Техред М.дидык

Редактор Н.Гунько

Корректор М.Самборская

Заказ 42.16/25 Тираъ: 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 тя 10-14 ч среду заменяют на свежую, содержащую 10 сыворотки.

Через 24 ч клетки рассеивают по

1 10 кл/см в чашки Петри диаметром

100 мм в среде ГАТ (гипоксантин

30 мкг/мл), аминоптерин 0,5 мкг/мл и тимидин 50 мкг/мл). Смену среды .осуществляют через каждые 2-3 дня.

Через 10-14 дней обнаруживают колонии трансформантов.

Пример 5, Определение про-, дукции HBSAg в клетках штамма ВСКК (Zz)82.

Культуральную жидкость при культивировании клеток предлагаемого штамма используют для тестирования

HBSAg в РПГА (реакция пассивная гемагглютинации). собой стабилизированные эритроциты кур, сенсибилизированные антителами к HBSAg. Результаты тестирования по5 казывают что титр HBSAg изменяется

Ф в пределах 1:4-1:64, в зави"имо"..ти от состояния клеток культуры.

С помощью реакции иммунофлюоре-. сценции (прямой и непрямой вариант с использованием моноклональных антител к HBSAg) изучают экспрессию НВЯАя в клетках.

Экспрессию HBSag наблюдают у 4550Е клеток популяции на 4-6 сут куль15 THBHPOBBHHR ° Штамм культивируемых клеток ге20 патокарциномы человека BCKK(II) В 82Д, дефектный по тимидинкиназе для гибридизации и трансфекции.