Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклональных антител к са @ /м @ - зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии. Цель изобретения - получение гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к CA<SP POS="POST">2+</SP>/MG<SP POS="POST">2+</SP> - зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека. Штамм получен путем слияния лимфоцитов селезенки мышей BALB/C и миеломы X63. AG8.653. Мышей иммунизируют экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, содержащим фермент CA<SP POS="POST">2+</SP>/MG<SP POS="POST">2+</SP> -зависимую эндонуклеазу. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N116Д. Секреция монАТ на 4-й день культивирования 10-20 мкг в 1 мл среды и 1-2 мг в 1 мл асцитической жидкости. МонАТ JGG<SB POS="POST">2</SB> мыши. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 30 пассажей в культуре и 10 пассажей на животных, если гибридома перевивается. 2 табл.

COI03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 149?21 11 4 С 12 N 5/00, А 61 К 39/395

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н д BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ домной технологии. Цель изобретения получение гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моно-клональные антитела (монАТ) к Са" /

/Mg2+ -зависимой эндонуклеазе кпеточных ядер лимфоцитов селезенки человека. Il.*òàìì получен путем слияния лимфоцитов селезенки мышей BAT,В/с и миеломы Х63.Ag 8.653, Мышей иммунизируют экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, содержащим фермент Са +/Mg + -зависимую эндонуклеазу. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) Р 116D, Секреция монАТ на 4-й день культивирования 10

20 мкг в 1 мл среды и 1-2 мг в 1 мл асцитической жидкости. МонАТ Jg С .мыши, Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении

30 пассажей в культуре и 10 пассажей на животных, если гибридома перевивается.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

llO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4273772/31 — 13 (22) 04.06.87 (46) 30,07,89, Бюп. Р"- 28 (71) Институт медицинской генетики .

AMH СССР и Институт медицинской энзимологии АМН СССР (72) А,И.Волгин, В.В.Волгина, Н,Н.Ходарев, И.И,Вотрин и Л,А.Певницкий (53) 578.085.23 (088,8)

1 д (56) Авторское свидетельство СССР

N - 1414870, кл, С 12 N 5/00, А 61 К 39/395, 30.03.87. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ЮЗБ MUSCUT.US — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К

Са" /Mg + -ЗАВИСИМОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЕ

КЛЕТОЧНЫХ ЯДЕР ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ

ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибриИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении моноклональных антител (монАТ) к Са + /Mg +-зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, Цель изобретения — получение гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих монАТ к Са д /Мф+— зависимой эндонуклеазе клеточных ядер . лимфоцитов селезенки человека.

Штамм получают следующим образом.

Штамм — продукт слияния лимфоцитов селезенки мышей ВАЬВ/с и миеломы

Х 63.Ag8.653. Мышей иммунизируют экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, содержащим фермент Са /Mg +-зависимую эндонуклеа- фЭ зу, при этом для иммунизации используют две схемы.

Первая схема. Мышей линии BALB/c, самцов массой 18-20 г иммунизируют подкожно в 5 точек с использованием полного адъюванта Фрейнда в дозе

100 мкг белка на мышь. Через 10 дней антиген вводят внутрибрюшинно в неполном адъюванте Фрейда в дозе

100 мкг белка на мышь, затем иммуни149721 3 зацию проводят внутривенно в дозе

200 мкг белка, В течение 6 мес животные отдыхают, затем им вводят внутривенно 100 мкг экстракта, через 7 дней иммунизацию повторяют внутриселезеночно в дозе 100 мкг белка экстракта и на третьи сутки после разрешающей иммунизации клетки селезенки берут на гибридизацию, 10

Вторая схема, Мышей той же линии иммунизируют дважды экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека с интервалом ? дней. Антиген вводят внутриселезеночно.в дозе

100 мкг по белку. Гибридизацию проводят на 4 день.

При гибридизации используют клетки миеломы 3 РЗ.Х63.Ag8.653, несекратирующие иммуноглобулины, находящиеся 20 в логарифмической фазе роста.

Мышей забивают, асептически извлекают селезенку и готовят суспензию клеток в гомогенизаторе, Суспензию клеток миеломы и селезенки иммунизированных мьппей смешивают в плоскодонном флаконе в соотношении 1:10, Затем флакон центрифугируют 200g 5 мин, удаляют супернатант и приливают к осадку по каплям

2 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля (М;В, 1500). Клетки суспендируют легким встряхиванием флакона.

Через 1 мин во флакон доливают 10 мл среды ДМЕМ, затем в течение 3 мин еще 50-60 мп. Флакон центрифугируют

200g 5 мин, удаляют супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 60 мл среды DMEM, 15% фетальной сыворотки.

Клетки инкубируют во флаконе при

37 С в течение 6-12 ч. После инкубации среду во флаконе заменяют на селективную, имеющую следующий состав: среда DMEM, 15% фетальной сыворотки, гипоксантин 5 ° 10- М, аминоптерин

2 10 М, тимидин 8 ° 10 M, гентами- 45 цин 80 мг/мл (среда DMEM-ГАТ).

Клетки в концентрации 2-3 10 кл/мл распределяют по лункам плоскодонных

96-луночных планшетов, дно которых предварительно покрыто фидерным слоем 50 сингенных перитонеальных макрофагов (6 10 клеток на лунку), Клетки куль5 о тивируют в планшетах при 37 С в атмосфере 5% СО и.при 96% влажности.

S5

Среду меняют каждые 3 сут на 50Х.

Массовая гибель миеломных клеток наблюдается, начиная с 3 дня культивирования, рост гибридных колоний .начинается на 5-7 день культивирования.

Тестирование надосадочных жидкостей проводят, начиная с 10-го дня культивирования после гибридизации. Гибридные клетки культивируют на среде

DMEM-ГАТ 30 дней, затем 10 дней на среде DYEM-ГТ (гипоксантин 5 ° 10 М тимидин 8 -10 М), после чего гибридо-4мы культивируют на среде ЖМЕМ, 15% фетальной сыворотки, Клонирование гибридом проводят методом лимитирующих разведений.

B результате тестирования надосадочных жидкостей от 200 первичных культур, полученных в результате слияния миеломы с лимфоцитами мышей, иммунизированных по первой схеме, получено 8 стабильных позитивных линий; по второй схеме иммунизации—

13 позитивных линий из 200 первичных культур. Все линии клонированы и заморожены в жидком азоте, Клон DK был клонирован еще 5 раз, для наработки антител клон DN культивируют в условиях in vivo в виде асцитной жидкости в брюшной полости сингенных мышей.

Полученный штамм DN депонирован под номером ВСКК(П) Р 116D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования — среда Дульбеко с добавлением

10% телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мм L-глутамина, 80 мкг/мл гентамицина, 37 С, 5% СО, 96% влажности, Допустимо использование среды Игла с добавлением 15Х сыворотки крупного рогатого скота, Для выращивания штамма используют стеклянную или пластиковую посуду, Во флакон объемом 25 см в 5 мл среды вносят 2 10 -10 клеток DN, Пассаж и 6

1 раз в 3-4 дня той же дозой клеток.

Кратность рассева 1:4.

Культивирование в организме животного, Для выращивания опухоли из штамма пригодны мыши линии BALB/ñ. Свежим мьппам за 7-30 (оптимально 14) дней до инъекции штамма вводят внутрибрюшинно 0 5 мл пристана, Штамм инъециЭ

6 руют внутрибрюшинно по 3,2х10 клеток на мышь в 1 мл среды Игла. Асцитическую жидкость собирают по мере появления (на 10-15 день). Из асцита штамм перевивают на свежих мышей по

1-5х10 клеток на мышь, 4-6 пассажей.

1497213

50

Продуктивность штамма.

Секреция монАТ на 4-й день культивирования 10 — 20 мкг в 1 мл среды и

1-2 мг в 1 мл асцитической жидкости.

Метод оценки синтеза антител — гетерогенный иммуноферментный анализ: пластик покрывают белком А, обрабаты— вают экстрактом клеточных ядер спленоцитов человека или очищенным препаратом Са + /Mg " -ДНК-азы, добавляют суперсперальную ДНК плазмиды рВК 322.

Положительную реакцию определяют по гидролизу суперспиральной формы плазмиды после электрофоретического анализа продуктов расщепления ДНК Са /

/Мд + -зависимой эндонуклеазой, Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 30 пассажей в культуре и 10 пассажей на животных, если гибридома перевивается.

Характеристика продукта.

Моноклональное антитело IgC мы2 ши, Моноклональные антитела способны связывать Са + /МВ + †зависим эндонуклеазу клеточных ядер спленоцитов человека эндонуклеазы ядер лимфоцитов периферической крови человека и крупного рогатого скота, гепатоцитов крыс, селезенки мышей линий СВЛ, C57BL/6 и BALB/ñ, Кроме того, монАТ реагируют с эндонуклеазами клеточных ядер тимоцитов линии BALB/с и не реагируют с эндонуклеазами тимуса мышей линий C57BL/6 и СВА, При хроническом лимфолейкозе крупного рогатого скота монАТ связывают эндонуклеазу лимфоцитов селезенки в большей степени, а фермент лимфоцитов перифери ческой крови в меньшей, чем в норме.

Эти антитела не реагируют с ДНК вЂ аз

I поджелудочной железы быка, щелочной фосфатазой человека, а также с белками крови человека.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в эмбриональной телячей сыворотке, содержащей 12,5 диметилсульфоксида, в концентрации

3-4х10 клеток в 1 мл, разливают в

6 пластмассовые ампулы при 4 С. Затем б клетки замораживают по программе до

-40 С снижение температуры на .1 С/

/мин, а затем до -196 С по 10 С/мин.

Размораживание: 1 мин при 37 С.Клетки разводят в 10 мл полной среды и переносят в культуральный флакон, Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длитель5

30 ном наблюдении и посевах «а питатель«ые среды.

Использование штамма иллюстрируется следующим примером.

Пример, Для определения наличия специфических антител в супернатантах гибридом используют плоскодонные планшеты, лунки которых предварительно обрабатывают белком А.

После промывки планшетов 50 мМ фосфат«ым буфером (РВВ) и обработки 1 ным бычьим сывороточным альбумином тестируемые образцы вносят в лунки и инкубируют в течение ночи при

0-4 С. Лунки промывают 4-6 раз РВ$, о наносят 50 мкл экстракта клеточных ядер спле«оцитов человека с концентрацией белка 0,5 мг/мл и инкубируют о

6 ч при 0-4 С. Лунки промывают 2 раза PBS и 2 раза буфером 10 MI! трис, рН 8,0, 10 мМ МяС1,, 1 мМ СаС1 (ИБ), затем вносят субстратную ДПКсуперспиральную форму плазмиды рВН

322 в концентрации 0,6 мкг/мл в ИВ о и инкубируют в течение 2 ч при 37 С.

Продукты расщепления плазмидной

ДНК разделяют в блоках {,2, агарозы, При нанесении надрезов на субстратной

ДНК суперспиральная форма плазмиды переходит в открытую кольцевую и линейную, которые отличаются от исход«ой суперспиральной формы по электр офоретической подвижности, Таким образом, о наличии антител к Са /

/Ng " †зависим эндонуклеазе судят по исчезновению суперспиральной ДНК и появлению открытой кольцевой и линейной форм плазмиды рВН 322, Полученные антитела DN взаимодействуют с очищенным ферментом Са +/

/Mg + -зависимой эндонуклеазой клеточных ядер спленоцитов человека.

Результаты связывания антител DN с очищенной Са" /М -зависимой эндонуклеазой спленоцитов человека следующие:

Антитела

Активность Ca +/I lg зависимой эндонуклеазы, сорбированной на антителах линии

ВК, /б

44,5

DN

Сыворотка круп— ного рогатого скота 0

При сорбции на антителах белковэкстрактов клеточных ядер селезенки человека, содержащих Ca"-+ /Yg + -зави1497213

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Nus muses>lus RCKK(II)

N 11бП вЂ” продуцент моноклональных антител к Са + /М82 -зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, Составитель Г,Смирнова

Редактор Н.Киштулинец Техред M.Ходанич .Корректор С.Черни

Заказ 4406/29 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,103 симую эндонуклеазу в комплексе антиген-антитело, обнаруживается фермент, проявляющий свойства, аналогичные очищенной Са " /Ng -зависимой эндонуклеазе. В частности, активность фермента в присутствии Ng2+ составляет не более 80 от активности в присутствии Са» и не более 32 от активности в присутствии Са + и Мд + .

Для определения видовой специфичности антител линии изучают их связывание с Са + /Mg -зависимой эндонуклеазой клеточных ядер селезенки человека, крупного рогатого скота и мышей линии BALB/ñ.

Связывание антител линии DN c

Са + /Ng> -зависимой эндонуклеазой. экстрактов клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека 100, мышей 551 и крупного рогатого скота 37 .. Полученные результаты показывают, что антитела DN обладают видоспецифичностью, хотя могут связывать и фермент эволюционно отдаленных видов живот-.:. ных.

Кроме того, изучено связывание антител DN с различными компонентами клеточного ядра — ДНК, ДНП, РНК и фракцией гистонов, Ни в одном случае связывание антител с названными компонентами не обнаружено.

Использование изобретения позволяет получать монАТ к Са +/Мд +-зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.

15 формула изобретения