Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая синтез hbs ag вируса гепатита b, и штамм вируса осповакцины - продуцент hbs ag вируса гепатита b

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой штаммпродуцент антигена HBs и рекомбинантную плазмиду для создания такого штамма. Рекомбинантная ДНК содержит лдве примыкающие копии гена HBs-антигена вируса гепатита B, каждой из которых предшествует промотор белка 7,5 кД вируса осповакцины, а обе копии фланкированы последовательностями Hind III-J-фрагмента ДНК вируса осповакцины. Рекомбинантный штамм продуцирует до 2200 нг HBs Ag/10⁶ кл. 24 ч. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую синтез HBs-антигена вируса гепатита В, и рекомбинантный штамм ВОВ, синтезирующий этот антиген. Целью изобретения является получение рекомбинантного штамма ВОВ, обеспечивающего повышенный уровень экспрессии HBs-антигена в эукариотических клетках. Повышение синтеза обеспечивается за счет трансформации рецепиентного штамма рекомбинантной плазмидой, содержащей две копии HBs-антигена. П р и м е р 1. Способ получения плазмиды pLD 206. Клетки E.coli НВ 101, содержащие плазмиду pVJ 11, выращивают в 1 л L-бульона с 50 мкг/мл ампициллина при 37^оС и аэрации до концентрации клеток 5-6х10⁸/мл среды, добавляют хлорамфеникол до конечной концентрации 170 мкг/мл до конечной концентрации 170 мкг/мл и продолжают инкубацию при интенсивной аэрации в течение 16-18 ч. Бактериальные клетки собирают центрифугированием (5000g, 20 мин, 4^оС) и из них выделяют плазмидную ДНК. Далее ДНК плазмиды очищают методом равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия с бромидом этидия (700 мкг/мл). 1 мкг ДНК плазмиды pVJ 11 инкубируют при 37^оС с рестрикционной эндонуклеазой EcoRI в буфере 1 (100 мМ трис-HCl, рН 7,5; 50 мМ NaCl; 6 мМ MgCl₂; 6 мМ 2 меркаптоэтанол). После полного расщепления (анализ при помощи электрофореза в 1%-ном агарозном геле) препарат прогревают 10 мин при 65^оС с целью инактивации фермента. EcoRi-фрагмент, содержащий структурный ген HBs Ag под контролем промотора Р7,5 ВОВ, получают следующим образом. 5 мкг ДНК-плазмиды pLD 1 инкубируют с рестрикционной нуклеазой EcoRI в буфере 1. После анализа на полноту рестрикции препарат ДНК разделяют электрофорезом в 0,6%-ном геле из легкоплавкой агарозы. Участок геля, в котором локализован фрагмент ДНК в 1700 н. п. вырезают, добавляют к нему 5 мл 5 мМ ЭДТА, рН 8,0, и прогревают 20 мин при 60^оС для растворения агарозы. Агарозу удаляют при помощи фенольной обработки. Далее раствор концентрируют бутанолом до объема 150 мкл и ДНК осаждают этанолом. Высаженную ДНК растворяют в 50 мл воды и используют для легирования и ник-трансляции. 0,3 мкг EcoRI-фрагмента обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в буфере следующего состава: 66 мМ трис-HCl, рН 7,6; 5 мМ MgCl₂, 5 мМ дитиотрейтол; 1 мМ АТФ, в течение 30 мин при 18^оС с целью получения димеров. К этой смеси добавляют 1 мкг ДНК плазмиды pVJ 11, обработанной рестриктазой EcoRI, и проводят легирование при 8^оС в течение 18 ч. Легированную смесь используют для трансформации клеток E.coli HB 101 (thi leu pro lac gal str rec A Endo I hsd R hsd M). Трансформанты высевают на L-среду с 2% агара и 50 мкг/мл ампициллина. По- лученные клоны переносят на нитроцеллюлозные фильтры и исследуют методом гибридизации колоний, используя в качестве зонда EcoRI-фрагмент в 1700 н.п. меченный ³²Р методом ник-трансляции. Плазмидную ДНК, выделенную из клонов, давших положительный сигнал гибридизации, анализируют при помощи рестрикционного анализа (использовали эндонуклеазы BamHI, EcoRI, Xва I, Hind III) и блот-гибридизации по Саузерну. Проведенный анализ позволяет отобрать клон, содержащий плазмиду pLD 206, cоcтоящую из векторной плазмиды pVJ 11 и двух EcoRI-фрагментов в противоположной по отношению друг к другу ориентации. П р и м е р 2. Способ получения рекомбинантного штамма ВОВ. Гомологичную рекомбинацию ДНК донорской плазмиды pLD 206 с геномом ВОВ проводят в перевиваемой культуре клеток почек обезьян (линия СУ-1). Клетки выращивают на среде Игла МЕМ с добавлением 10% сывоpотки эмбрионов коров (СЭК) во флаконах площадью 25 см². Клетки достигают состояния полного монослоя через 48 ч после посева. Культуральную среду из флаконов удаляют, клеточный монослой промывают фосфатным буфером (рН 7,1) и заражают ВОВ с множественностью 0,05 БОЕ/кл. Для заражения используют лабораторный штамм WR дикого типа, адаптированный к размножению в условиях культуры клеток. Через 2 ч после заражения проводят трансфекцию инфицированных клеток ДНК плазмиды pLD 206. Для этого 5 мгк ДНК pLD 206 и 15 мкг ДНК тимуса теленка в качестве носителя растворяют в 1 мл буфера следующего состава: 20 мМ Hepes (рН 7,05); 0,14 М NaCl; 5 мМ KCl; 1 мМ Na₂HPO₄; 0,1% α- D глюкозы. Затем добавляют CaCl₂ до конечной концентрации 125 мМ. Смесь оставляют на 30 мин при комнатной температуре для образования ДНК-кальциевого комплекса, а затем вносят в культуру зараженных клеток. Через 30 мин после трансфекции добавляют 10 мл ростовой среды МЕМ с 8% СЭК, инкубируют 3,5 ч при 37^оС. Затем среду заменяют на свежую ростовую и продолжают инкубацию в течение 48 ч. Обычно к этому сроку вирус оказывает цитопатогенное действие на все клетки культуры. Клетки стряхивают со стекла и собирают центрифугированием при 800g в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл среды, трижды замораживают, оттаивают для высвобождения вируса из клеток. Селекцию рекомбинантов проводят в культуре клеток 143 ТК- в присутствии 30 мкг/мл 5-бромдезоксиуридина. Поскольку целостность гена тимидинкиназы (ТК-гена) в составе плазмиды pLD 206 нарушена, то вирусы рекомбинанты приобретают ТК-генотип, т.е. способность развиваться в присутствии 5-бромдезоксиурицидина в отличие от вируса дикого типа, имеющего ТК⁺ генотип. Выделенные ТК- -клоны размножают в культуре клеток СУ-1 и иммобилизуют на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах. Иммобилизованную ДНК клонов гибридизуют с BaMHI-фрагментом геном вируса гепатита В, содержащим ген HBd Ag, меченным ³²Р. Доля клонов-рекомбинантов составляет около 20% всех выделенных ТК-клонов. Клоны рекомбинанты анализируют на экспрессию HBs Ag в культуре зараженных клеток СУ-1 в реакции ИФА. Клон ВОВ, давший максимальную экспрессию антигена, подвергают последовательному двухкратному клонированию методом бляшек с целью получения генетически однородной популяции вируса. П р и м е р 3. Уровень экспрессии HBs Ag в культуре клеток, зараженных рекомбинантным штаммом ГЛД-9331-HBs Ag-2. В чашки Петри площадью около 20 см² засевают культуру клеток СУ-1 в среде ДМЕМ с 10% СЭК из расчета 150000 кл/мл, а всего 750000 кл/чашку. Через 48 ч после посева в чашках образуется сплошной монослой. Из 3 чашек клетки снимают версеном и подсчитывают их количество в камере Горяева для каждой чашки отдельно. Количество выросших клеток составляет (2 ±0,1) х 10⁶. 48-часовую культуру клеток заражают рекомбинантным штаммом ГЛД-854-HBs Ag-1 или ГЛД-9331-HBs Ag-2, содержащим соответственно одну или две копии экспрессируемого гена HBs Ag, с множественностью 30 БОЕ/кл (по 3 чашки соответственно на каждый вариант). Объем инокулята составляет 0,2 мл. По окончании периода адсорбции инокулят отсасывают, в чашки вносят по 5 мл среды МЕМ с 1% СЭК и инкубируют в термостате при 37^оС в атмосфере СО₂ при влажности 98% Через 24 ч после окончания периода адсорбции из чашек отсасывают культуральную среду. Клетки ресуспендируют в 2 мл свежей среды и разрушают ультразвуком для экстракции из клеток HBs Ag. Полученную смесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин для удаления клеточного дебриса. Содержание HBs Ag в клеточной фракции и в культуральной среде определяют методом ИФА. Исследуемые образцы клеточных фракций и культуральной среды готовят в разведениях 1: 2 1:10240. Определяют средние значения оптических плотностей (ОП) при длине волны 490 нм на фотометрирующем устройстве для 2 образцов положительного контроля из 4 образцов отрицательного контроля, установив "ноль" по субстратному раствору в чистых лунках, т.е. за вычетом значений фона. Результаты ИФА считают отрицательными, если ОП исследуемого образца не превышает ОП отрицательного контроля более, чем в 2,5 раза. Минимальная выявляемая концентрация HBs Ag с помощью набора составляет 1 нг/мл. Результаты определения уровня экспрессии HBs Ag в культурах представлены в таблице. Как видно из данных таблицы, уровень синтеза HBs Ag зависит от дозы гена: использование штамма с двумя копиями гена HBs Ag приводит к достоверному увеличению количества синтезируемого HBs Ag. В культуре клеток CУ-1 уровень HBs Ag при этом достигает 2240 нг/10⁶ кл˙24 ч, причем свыше 70% его секретируется в культуральную среду. На более поздних сроках инфекции уровень секреции достигает 85% П р и м е р 4. Плавучая плотность HBs Ag, синтезируемого рекомбинантным штаммом ГЛД-9331-HBs Ag-2. 50 мл осветленной культуральной среды, содержащей рекомбинантный HBs Ag, центрифугируют при 73000 g в течение 24 ч для осаждения HBs Ag. Полученный осадок ресуспендируют в 0,01 М трис-HCl буфере, рН 7,2; наносят на ступенчатый градиент плотности 1,1-1,6 г/см³ хлорида цезия и центрифугируют в роторе SW 40 Бекман при 170000 g в течение 64 ч. Полученный градиент фракционируют по 0,5 мл и определяют плотность хлорида цезия в каждой фракции. Затем аликвоты, взятые по 50 мкл из каждой фракции, разводят в 10 раз и определяют в них содержание HBs Ag методом радиоиммунного анализа. Плавучая плотность рекомбинантного HBs Ag составляет 1,2 г/см³, что соответствует плотности HBs Ag, получаемого из плазмы крови.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК rLD 206, кодирующая синтез HBs Ag вируса гепатита В, мол.м. 7,3 МД, размером 11,1 т.п.о. содержащая плазмидную ДНК вектора RUI размером 7,7 т.п.о. две копии EcoRI-фрагмента плазмиды pLD 1 с фрагментом генома вируса гепатитов B подтипаAdW размером 1,35 т.п.о. под контролем промотора белка 7,5 кД ВОВ размером 350 п.о. и общим размером 3,4 т. п. о. уникальные сайты для эндонуклеаз рестрикции: 4BamHI, 3 EcoRI, xba1 и hind 111; генетические маркеры: amp^r устойчивость к ампициллину. 2. Штамм вируса осповакцины ГКВ N 2126 продуцент HBs Ag вируса гепатита B.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2002

Извещение опубликовано: 10.04.2002        

---