Способ получения лактатоксидазы
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способов получения лактатоксидазы. Цель изобретения - упрощение способа, и расширение его функциональных возможностей и повышение выхода фермента. В качестве продуцирующего микроорганизма применяют штамм ACETOBACTER SUBOXYDANS VAR. MUCIPARUM FRATEUR N C1B 5595 (1950-1280), способный синтезировать лакта-оксидазу, окисляющую лактат до пирувата и Н<SB POS="POST">2</SB>О<SB POS="POST">3</SB>, посевной материал которого выращивают на творожной сыворотке, являющейся дешевым натуральным источником молочной кислоты. Способ позволяет получить лактатоксидазу с активностью 7,75 ед/мл, удельной активностью 1,2 ед/мг белка при выходе 790,5 ед/л.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
H А BTOPCHOIVlV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
flP ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4291441/31-13 (22) 28.07.87 (46) 15.11.89. Бюл. P- 42 (71) Институт биохимии АН ЛитССР (72) Н.N, Лукошявичене, Г.-Г.P. Браженас, Б.С. Куртинайтене и Г.В. Павленко (53) 577. 15(088. 8) (56) Патент США h". 4166763, кл. G 01 N 31/14, опублик. 1979.
Саппо I.I., Li Fu Chen, Tlickinger И.С., Tsao Т.G. The development
of Immobilized Lactate 0xidase System
for Lactic Acid Analysis.-Biotechnol.
and Bioengin, 1984, v. 26, р. 167-173 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАКТАТОКСИДАЗЫ (57) Изобретение относится к. микробиИзобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения фермента лактатоксидазы, превращающей молочную кислоту (лактат) в пировиноградную кислоту (пируват) и Н Об, который может быть использован в аналитических системах, применяемых в медицине, пищевой и микробиолоической промышленности.
Цель изобретения — упрощение способа,расширение его функциональных возможностей и повышение выхода фермента.
Способ осуществляют следующим образом.
В качестве продуцента используют штамм Acetobacter suboxygans var.
nuciparum Frateur Ф С1В 5595 (1950— (51)4 С 12 N 9/02//(C 12 N 9/02, С 12 R 1:02) 2 ологической промышленности и касается способов получения лактатоксидазы.
Цель изобретения — упрощение способа, расширение его функциональных возможностей и повышение выхода фермента.
В качестве продуцирующего микроорганизма применяют штамм.Acetobacter
suboxydans var muciparum Frateur
N - CIB 5595 (1950-1280), способный синтезировать лактатоксидазу, окисляющую лактат до пирувата и Н О, посевной материал которого выращивают на творожной сыворотке, являющейся дешевым натуральным источником молочной кислоты. Способ позволяет получить лактатоксидазу с активностью С2
7,75 ед/мл, удельной активностью
1,2 ед/иг белка лрк выходе /90,2 ед/л. (/) 1280) . Посевной материал продуцента выращивают на питательной среде, содержащей молочную кислоту, источником которой служит творожная сыворотка. В ходе сбраживания молока содержащаяся в нем лактоза превращается в молочную кислоту, которая после отделения сгустков молочных белков, т.е. творога, остается в сыворотке и составляет 0,92-1,24%. Концентрации мо- лочной кислоты в творожной сыворотке менее 0,96% и более 1,24% маловероят- В ны, исходя из режима технологического . процесса приготовления творога. Творожная сыворотка является дешевым отходом технологического процесса приготовления творога.
1521774
Активность полученной лактатоксида з ы опр едел яют сне ктр офотометрич еским методом, исходя из схемы заданного способа превращения молочной кисло5 ты: молочная кислота + О лактатокси— пировиноградная кислота + Н О . даза
Метод включает взаимодействие лактатоксидазы с субстратом — I, — ìoëo÷íîé 10 кислотой в цитрал-фосфатном буфере, рН 6,5, и детектирование образовавшейся Н О пероксидазой, что визуализируется присутствием в реакционной смеси о-фенилендиамина, Единицу ак-,: 15 тивности лактатоксидазы выражают количеством фермента, превращающего
1 мкмоль молочной кислоты в пировиноградную кислоту и Н <(f z при рН 6, 5,.
25 С в течение 1 мин.
-0
Способ поясняется следующими примерами.
If р и м е р 1 (контроль) . Способ включает следующие этапы: поддерживание культуры B пробирках, выращивание 25 посевного материала в колбах и культивирование микроорганизма в колбах в присутствии молочной кислоты, отделение биомассы, разрушение клеток, центрифугирование их гомогената с целью получения растворимого ферментасыр ца, Поддерживание .культуры Auetobaoter
suboxydans var . muciparum Frateur
19 50-1289 .
Культура поддерживается в пробирках на скошенном агаре и в колбах с жидкой питательной средой переменно.
Состав агаризованной среды следующий, г/л: дрожжевой экстракт 10, глюкоза
10; пептон 5; мел 10, агар 15. Источники углерода — глюкоза, сорбит, глицерин, периодически Меняют. Жидкие среды для поддерживания культуры представляют собой питательные среды, применяемые для выращивания посевного материала, состав которых приводится ниже, На скошенном агаре культура сохраняется в течение 1 мес, а в жидких средах — 2-3 сут.
Выращивание посевного материала и культивирование продуцента в колбах.
Бактерии со скошенного arapa пере-, сеивают в колбы с питательной средой, состав которой соответствует указанному в прототипе: 10 г/л 85Х-ной D, L-молочйой кислоты; 5,0 г/л дрожжевого экстракта; 2,0 г/л К<НРО4 3HzO;
j2,0 г/л 38804,7Н О,. 500 мл пивного сусла, 500 мл фталатного буфера, рН
5,5. Посевной материал выращивают в течение 1 сут при 25 (: на качалке при 150 колебаний/мин.
Пос евной материал в количестве 5Х переносят в колбы с ферментационной средой, состав которой соответствует указанному в прототипе, г/л: NH4Cl
1,5; .дрожжевой экстракт 1,0; Na 5 О; КдНРО4 4 О M8SO4 7HzO 0 2; MnS0 НдО 0 08; 37 5 мп/л 40 -ной D, L-молочной кислоты, рН среды уравновешивают с NH ОН до 5,2. Культивирование продуцента проводят в течение 24 ч при 25 С на качалке при 150 колебаний/мин. Отделение биомассы, ее гомогенизация и центрифугирование клеточного гомогената. Биомассу отделяют центрифугированием 3000 об/мин в течение 30 мин.Выход биомассы составляет 12 г/л питательной среды, т.е. 2,4 r сухой массы/л из расчета, что сухое вещество клетки составляет около 20Х. Клетки 3-кратно промывают цитратфосфатным буфером, рН 6,5, суспендируют в этом же буфере в соотношении 1:3 и обрабатывают ультразвуком частотой 22 кГц в течение 6 мин, Клеточный гомогенат центрифугируют при 100000 в течение 3,5 ч при 4 С. Супернатант представляет собой фермент-сырец, лактатоксидазная активность которого достигает 6 100 ед/л (6, 1 ед./мп). Концентрация белка 6,0 мг/мл, т.е. активность 1 мл фермента в пересчете в соотношении с количеством белка в этом же объеме 1 ед/мл. Выход фермента-сырца в пересчете на 1 л питательной среды (масса биомассы умноженная на объем буфера, в котором она суспендируется, и на активность 1 мп фермента-сырца) 219,6 ед. Пример 2. Культивирование . продуцента с применением творожной сыворотки в качестве источника молочной кислоты для выращивания посевного материала, Поддерживание культуры АсесоЬаеr.er suboxydans var. muciparum Frateur . 1950-1280 проводят по примеру 1. Посевной материал выращивают в колбах на питательной среде, приготовленной на основе творожной сыворотки, содержащей 0,96 молочной кислоты, с до-, бавкой 5,0 г/л дрожжевого экстракта, рН питательной среды 5,2. Творожную 1521774 6 Выход биомассы составляет 32 г/л питательной среды (в пересчете на сухую массу 6,4 г/л) . Активность полученного образца лактатоксидазы составляет 7700 ед./л, т,е. 7,7 ед./мл. Выход фермента в пересчете на 1 л питательной среды 739,2 ед. Преимуществом способа является упрощение получения лактатоксидазы, превращающей молочную кислоту в пировиноградную кислоту и Н О.2 при применении доступного микроорганизма и простой питательной среоОоо. Составитель Е. Воробьева Техред Л.Олийнык Корректор С. Черни Редактор Н. Киштулинец Заказ 6892/24 Тираж 501 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская -наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул . Гагарина,101 сыворотку подщелачивают до рН 5 2 У ° автоклавируют при 0,5 атм в течение 3 мин и хранят при 4 С. Перед прим о нением дважды фильтруют через бумажный фильтр. Далее выращивание посевного материала и культивирование продуцента проводят по примеру 1. Выход биомассы составляет 34 г/л питательной сре ды (в пересчете на сухую массу 6,8 r/ë). Получение фермента-сырца проводя по примеру f. Активность полученнЬг образца лактатоксидазы составляет 7750 ед/л, т.е. 7,8 ед./мл. Концентрация белка 7,6 мг/мл, т.е. активность 1 мл фермента в пересчете в соотношении с количеством белка в этом же объеме 1,2 ед/мг. Выход фермента в 20 пересчете на 1 л питательной среды 79О, 5 ед. Пример 3 ° Поддержание культуры Acегоbacter oxydans var. muciparum Trateur 1950-t 280 проводят по приме-25 ру t.Посевной материал выращивают в кол1 бах на питательной ср еде, пригот овленной на основе творожной сыворотки, содержащей 0,96% молочной кислоты, с добавкой 7 мл/л 40,-ной молочной кис- 30 лять (суммарная концентрация 1,24 ) и 5,0 г/л дрожжевого экстракта, рН питательной среды 5,2. 5/ (5 мл) инокулята переносят в ферментативную среду, и процесс далее проводят по примеру Фор мула изобретения Способ получения лактатоксидазы, предусматривающий выращивание посевного материала продуцента из рода Acecobacter на питательной среде, содержащей источник молочной кислоты и дрожжевой экстракт, внесение инокуля.— та посевного материала в ферментаци-, онную среду и культивирование до максимального накопления фермента, отделение биомассы, ее гомогенизацию и центрифугирование, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью упрощения способа, расширения его функцио-. нальных возможностей и повышения выхода фермента, в качестве продуцента используют штамм Acetobacter suboxydans var muciparum Yrateur NCfB 5595, а в качестве основы питательной среды и источника молочной кислоты для выращивания посевного материала используют творожную сыворотку.
