Штамм бактерий paracoccus dеniтrifiсаns-продуцент эндонуклеазы рестрикции р @ 121

 

Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является выявление штамма - продуцента PARACOCCUS DENITRIFICANS ВКПМ В - 4152, обеспечивающего получение эндонуклеазы рестрикции PDE 12 1, являющейся изошизомером рестриктазы SAU 96 1 и способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GGNCC. Штамм выделен в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш, непатогенен для человека, нетребователен к питательным средам, легко разрушается ультразвуком, обеспечивает повышенный выход целевого продукта, составляющий 3000 ед/г биомассы. Штамм PARACOCCUS DENITRIFICANS В - 4152 продуцирует эндонуклеазу рестрикции PDE 12 1, имеет сайт узнавания GGNCC, идентичный сайту узнавания SAU 96 1.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51) 4 С 12 N 9/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4392191/31-13 (22) 15,03.88 (46) 30.12.89. Бюл. Ф 48 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ и Институт микробиологии и вирусологии АН

КазССР (72) С.Х. Дегтярев, Н.И. Речкунова, M.È. Новожилова, Г.В. Семенченко и P.Ø. Галимбаева (53) 577. 15(088.8) (56) Roberts R.I. Restriction and.

modification enzymes and their rocognition seguences. - Nucl. Acids.

Res, 1985, 13. Suppl. 165-200.

Jentsch S., Gunthert U., Trauther T. А. Мыс1. Acids Res. 1981, 12, 2753-2759.

Hyghes S.G., Bruce Т. and

Murray К. (1980), Biochem I., 1985, 59-63.

Sussenbach I,$., Steenbergh P.M., Rost I.À., Van Deemven W.I., Van

Enb den I. D.À., À second site — specific

restriction endonuclease from staphylococcus aureus. — Nucl. Acids.

Res. 1978, 5, 1153-1163.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GGNCC.

Целью изобретения является выявление нового штамма — продуцента, „„SU„„1532583 А1

2 (54) ШТАИИ БАКТЕРИЙ PARAC0CCUS DENITRIFICANS — ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЭЫ

РЕСТРИКЦИИ Pde 12 I (57) Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является выявление штамма — продуцента

Paracoccus denitrificans ВКПМ В-4152, обеспечивающего получение эндонуклеазы рестрикции Pde 12 I, являющейся изошизомером рестриктазы Sau

96 Е и способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов

GGNCC. Штамм выделен в результате поиска штаммов — продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш, непатогенен для человека, нетребователен к питательным средам, легко разрушается ультразвуком, обеспечивает повышенный выход целевого продукта, составляющий 3000 ед/г биомассы. Штамм Paracoccus denitrificans В-4152 продуцирует эндонуклеазу рестрикции

Pde 12 I, имеет сайт узнавания

GGNCC, идентичный сайту узнавания

Sau 96 I. обеспечивающего более высокий выход целевого продукта, непатогенного для . человека и нетреббвательного к питательным средам.

Штамм бактерий Paracoccus denitrif icans ВКПМ В-4152 выделен в резуль-тате поиска штаммов-продуцентов

1532583 р отриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш, Штамм Paracoccus denitrificans

В 4152 характеризуется следующими м рфологическими, культуральными и ф зиологическими признаками: клетки с ерические 1-1 1 мкм в диаметре, в тречаются поодиночке, в парах или а регатах. В молодых культурах могут в тречаться короткие палочковидные к. етки. Неподвижные. Накапливают полиВ оксибутират. Грамотрицательные. Мет болизм дыхательный. Реакции на ок.— с лазу и каталазу положительные. Не г лофилы, нет потребностей в ростов rx факторах, яелатину не разжижают.

Ш амм хранится в 50%-ном глицерине в, T. — áóëüîíå при -20 С.

На рыбопептонном агаре образует к лонии серовато-белые, блестящие

8 9 мм в диаметре с неровными краям, плоские, не врастают в агар. Рост о ильный. В РПБ образует равномерную м ть, осадок. Хороший рост на синте- 25 т знеской среде с минеральным азотом.

Продуцируемая предлагаемым штаммом р стриктаза характеризуется следующ ми свойствами: узнает и специфическ расщепляет последовательность нукле 0 тидов GGNCC; оптимальное значение рН я действия рестриктазы 7,5-9,0; птимальная температура действия 37 С; я активности рестриктазы требуются оны Мо, оптимальная концентрация 35

-15 мМ.

Для культивирования Par.den В-4152 рименяют питательную среду следуюего состава, г/л дистиллированной воы; триптон 10, дрожжевой экстракт 40 с о

Культивирование проводят при 30 С с хорошей аэрацией в течение 2 сут.

1 ыход биомассы 2-3 г/л культуральной жидкости. Выход рестриктазы Pde 12 I: 45

: 000 ед/г биомассы.

Пример . Клетки Par. den. хранящиеся в 50 .-ном глицерине в Т; бульоне при t -20 С высевают на чашКу с 1. А. После 2 сут инкубирования

1 ри 30 С клетки собирают петлей и носят в 100 мл В и выращивают до плотности 1,5 при 30 С. Затем куль туру вносят в 2 л В выращивают до

1 лотности 2,5 при 30 С. После охлажо 55 ения клетки собирают центрифугироваиием. Выход биомассы 2 3 r сырого веса с 1 л средыо

4 r клеток суспендируют в 20 мл

0.02 М буффера трис-НС1 рН 7,5, содержащего 0.001 м р-меркаптоэтанол и 0,1 тритон Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при 4 С) и надосадочную жидкость наносят на 30 мл фосфоцеллюлозы P-11 (Whatman), уравновешенной буфером А (0,02 М калийфосфатный буфер, рН 7.5; 0,001 М ф-меркаптоэтанол, 5 .10 М ЭДТА), затем колонку промывают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате.

Адсорбированный материал элюируют раствором 1 M NaC1 в буфере А. Затем

60 мп полученного смыва белков с колонки диализуют в течение ночи против

2 л буфера А и наносят на 10 мп ДЕАЕцеллюлозы (ДЕ-52, Whatman, Англия), уравновешенной буфером А и элюируют

100 мп градиентом 0-1,0 М NaC1 в буфере А. Объем каждой фракции 5 мл. Аликваты из каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при 37 С с 1 мкл ДНК фага С1857 и анализируют в геле агарозы, Фракции, расщепляющие ДНК фага (7-9), объединяют, диализуют 3 ч против 2 л буфера А и наносят на 4 мл фосфоцеллюлозы P-11 (Whatman, Англия) и элюируют 40 мл градиентом 0-0,1 M NaCl в буфере А. Объем каждой фракции

2 мл. Фракции, содержащие Pde 12 I, определяют также, как при хроматографип на ДЕАЕ-целлюлозе. Фракции 14, 15, содержащие Pde 12 I, объединяют и диализуют против буфера А, содержащего 0,1 M NaC1 и 50%-ный глицерин.

Полученный препарат фермента (1 мл) имеет удельную активность 12000 ед/мл.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, не:-:бходимое для полного расщепления мкл ДНК фага Р в течение 1 ч при о

Э7 С. Ферментный препарат хранят при -20 С. Из 1 г биомассы получают

3000 ед. рестриктазы Pde 12

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Pde 12 I, проводят гидролиз ДНК фаза Л и pBR 322 рестриктазами Pde 12 I u Sau 96 I по отдельности, а также совместный гидролиз ,этими рестриктазами. Наблюдается ,картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Pde 12 I u Sau 96 I

1532583 6 ный выход целевого фермента, составляющий 3000 ед/г биомассы (в 12 раэ больше, чем в прототипе).

5 Формула изобретения

Составитель Н. Ходарев

Редактор Т. Лазоренко Техред Л.Сердюкова Корректор В. Кабаций

Заказ 8070/36 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета. по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,!01

5 порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза Pde 12 I является изомером рестриктазы Sau 96 узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов GGNCC.

Полученный штамм непатогенен для человека; легко разрушается ультразвуком, а также обеспечивает повышенШтамм бактерий Paracoccus denitrificans ВКПИ В-4152 — продуцент зндонуклеазы рестрикции Pde 12 I.