Способ получения рестриктазы sfa ni,способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 @ -gcatcn @ ,3 @ -cgtagn @

 

Изобретение относится к микробиологии , в частности к способам получения ферментов нуклеинового обмена . Цель изобретения - повьппение удельного выхода и удельной активности рестриктазы SfaHI. Штамм Streptococcus faecalis В-2293, продуцент рестриктазы Sfa N I, выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: триптон 10, глюкоза 5, дрожжевой зкстракт 5, 68 до достижения , оптической плотности 2,4-2,8 о.е. i при Л 600 нм. Биомассу осаждают центрифугированием и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе, клеточные обломки осаждают повторным центрифугированием. Очищают хроматографией на фосфоцеллюлозе Р-11, а затем на DEAE-целлюлозе, концентрируют хроматографией на целлюлозе Р-11. 4 табл. (Л 4а N9 S Од

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H д BTOPCH0IVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4265156/28-13 (22) 20.04.87 (46) 07.12.88. Бюл. Ф 45 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт .молекулярной биологии (72) О.А.Жилкина, В.Е.Репин и С.Х.Дегтярев .(53) 577.15(088.8) (56) Janulaitis А., Narcinkevicie" пе L.,,Petrusyte M., Nironov А.

А. new Sequence-specific endonuclease from Streptococcus durans. — FEBS

Letters, 1981, 134, 172-174.

Fitzgerlad G.F., Daly С., Brown L.R., Gingeras Т.R. So".FI:

А new sequence-specific endonuclease

from Streptococcus cremoris. — Nucleic Acids Res, 1982, 10, 24, 81718179 ..

К5 В " King С.Т., Jay E. А new

sequence-specific endonuclease from, Streptococcus faecalis subsp. гушоgenes. — Gene, 1978, 4, 4, 329-336.

„„SU„„, 1442546 А1 (51) 4 С 12 М 9/14, 15/00//

//(С 12 N 9/14, С 1.2 R 1:46 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ

SFA NI, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ

5 -ССАТСК, 3 -CGTAGN+k " (57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам получения ферментов нуклеинового обмена. Цель изобретения — повышение удельного выхода и удельной активности рестриктазы Ыа Н ?. Штамм Streptococcus faecalis В-2293, продуцент рестриктазы Sfa N I, выращивают на питательной среде следующего .состава, г/л: триптон 10, глюкоза 5, дрожжевой экстракт 5, КНхРО4 68 до достижения оптической плотности 2,4-2,8 о.е. при A =600 нм. Биомассу осаждают цент- уу рифугированием и разрушают на ульт- M Ф развуковом дезинтеграторе, клеточные обломки осаждают повторным центрифу- гированием. Очищают хроматографией на фосфоцеллюлозе P-11, а затем на

DEAR-целлюлозе, концентрируют хрома- тографией на целлюлозе P-11. 4 табл. lsd

4ь

1442546

Изобретение относится к микробиологии и касается способов получения ферментов нуклеинового обмена, в частности рестриктаз. 5

Целью изобретения является повышение удельной активновти и выхода целевого продукта.

Для осуществления способа подбирают концентрацию неорганического фосфа10 та. Экспериментальные данные представлены в табл. 1.

Как виднб из табл. 1, оптимальная концентрация КН РО4 составляет 68 г/л и значительно (в 34 раза) превышает 15 концентрацию КН РО4 в известном способе.

Оптимальную фазу роста, при которой следует прекратить культивирование и начинать сбор урожая, подбира- 20 ют, исходя из экспериментальных данных, приведенных в табл. 2.

Наибольший удельный выход рестриктазы наблюдается при оптической плотности 2,4-2,8 о.е. 25

Биомассу осаждают центрифугированием и подвергают разрушению на ультразвуковом дезинтеграторе MSE.

Клеточные обломки осаждают повторным центрифугированием. Хроматографичес- 30 кую очистку проводят, используя фосфоцеллюлозу Р-i 1, дальнейшую очистку ведут на DEAE-целлюлозе. Концентрирование осуществляют хроматографией на Р-11 целлюлозе.

Пример 1 (по известному способу), Получение рестриктазы SfaN I из Streptococcus faecalis ND 547.

Клетки высевают на чашки с питательной средой следующего состава„ г/л: триптон (ВЫсо) 10; дрожжевой экстракт (Difco) 5; глюкоза 5;

КН Р04 2 (рН 7,2); агар 15, инкубируют при 37 С. Выросшие клетки вноо сят бактериологической петлей в

100 мл жидкой питательной среды такого же состава (без агара) и культивио руют при 37 С. Затем инокулят вносят в 2 л свежей питательной среды и культивируют до оптической плотности

i 5 о.е. при длине волны 9,-=600 нм.

Биомассу осаждают центрифугированием на центрифуге,J - 21, ротор J А—

10,8 тыс. об/мин 15 мин. Выход биомассы 6,6 г.

Биомассу суспендируют в 48 мл

10 мМ трис-HCl (рН 7,5), содержащего

10. мИ 2-меркаптоэтанола, и разрушают в ультразвуковом дезинтеграторе MSE три раза по 40 с на частоте 20 кГц, амплитуда 12 мкм ° Клеточные остатки осаждают при 16 тыс. об/мин в течение

30 мин. Осветленный супернатант наносят на колонку с BiO Gel А 0,5М.

Фракции, содержащие эндонуклеазные активности, собирают и концентрируют диализом против fOOX глицерина и далее диализируют против буфера 1, содержащего 10 мИ К-Р (рН 7,4), 10 мИ

2-меркаптоэтанола, 0,1 мИ ЭДТА и 107. глицерина. Пробы наносят на колонку с DEAE-целлюлозой. Элюцию ведут в линейном градиенте 0-0,5 М КС1 в буфере 1. Эндонуклеазу диализуют и очищают в колонке с фосфоцеллюлозой (0,5х х15 см). Элюцию ведут линейным градиентом 0-1,0 .И КС1 (140 мл) в буфере 1. Эндонуклеазные пробы собирают и используют в экспериментах. Выход рестриктазы 150 е.а./r биомассы. Активность фермента 600 е.а./мл.

Пример 2 (по предлагаемому способу). Получение Sfa N I.

Культивирование ведут как в примере 1, только в составе питательной среды вместо дрожжевого экстракта фир-, 11 1t мы ВЫсо используют дрожжевой экстракт НПО "Биолар", а концентрация

КН РО4 составляет 68 г/л. Культивирование ведут до оптической плотности

2,4. Выход биомассы 11,2 г.

Выделение и очистка Sfa М I ° Выделение фермента проводят при 4 С. Биомассу ресуспендируют в буфере А (0,05 М трис-НС1, рН 7„5; 5,4 10 М

ЭДТА, О, 1 M 2-меркаптоэтанол, 0,2Х

NP-40) в соотношении 6 r биомассы на

20 мл буфера. Разрушают ультразвуком в ультразвуковом дезинтеграторе MSE три раза по 40 с на частоте 20 кГц, амплитуда 12 мкм.

Осаждают клеточные остатки при

16 тыс. Oб/мин в течение 30 мин °

Осветленный супернатант наносят на колонку с фосфоцеллюлозой P-11, предварительно уравновешенную буфером В (0,02 M КН РО4, рН 7,5; 5,4 10 M

ЭДТА, 0,1 М 2-меркаптоэтанол), колонку промывают этим же буфером, объем которого равняется двум объемам смолы. Сорбированный на фосфоцеллюлозе белок смывают 1 M NaCl в буфере, собранный белок диализуют 3 ч против

3 л буфера и наносят на колонку с

ВЕАЕ-целлюлозой. Элюцию проводят 40мл буфера В с линейным градиентом NaC1 (Π— 1 И), собирают фракции по 2 мл.

1442546

Пример 6. Фермент получают по примеру 3, но концентрация глюкозы

3 г/л. Отмечается увеличение лаг-фазы, выход фермента 580 е.а./г.

H p и м е р 7. Фермент получают по примеру 3, но концентрация глюкозы

1 г/л. Отмечается увеличение темпов роста, но выход фермента снижается до 500 е.а./г.

Пример 8. Фермент получают по примеру 3, но концентрация дрожжевого экстракта 10 г/л. Резко ингибирует рост культуры, фермент не удается тестировать.

Пример 9. Фермент получают по примеру 3, но концентрация дрожжевого экстракта 3 г/л. Отмечается увеличение лаг-периода, выход фермента

300 е.а./г.

Концентрацию триптона подбирают, исходя из экспериментальных данных, представленных в табл. 4.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход биомассы с 1 л культуральной жидкости в 1,5-2,0 раза, увеличить выход фермента на 1 г биомассы в 4 раза и повысить его активность в 6-7 раз (табл.3).

Способ получения рестриктазы

Sfa N I, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов

5 -GCATCN >, 3 -CGTAGN 4, включающий культивирование продуцента штамма

Streptococcus faecalis при 37 С в питательной среде, содержащей триптон в концентрации 10 г/л, глюкозу и дрожжевой экстракт в концентрации по 5 г/л, двуэамещенный фосфат калия и воду, центрифугирование биомассы, разрушение клеток ультразвуком и хроматографическую очистку, включая, ДЭАЭ-целлюлозу и фосфоцеллюлозу, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения удельной активности и выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Streptococcus faecalis BIUIM В-2293, культивирование ведут на среде, содержащей двузамещенный фосфат калия в концентрации 68 г/л, до достижения оптической плотности 2,4-2,8 о.е. при A=600 мм.

Фермент элюируют при 0,4-0,6 M NaCl.

Фракции, содержащие ферментативную активность, собирают, диализуют 3 ч против 3 л буфера В и концентрируют

5 с помощью хроматографии на P-11 целлюлозе объемом 3-5 см . Элюцию проводят градиентом NaC1 в буфере В, 40 мл

0 — 1 Г1. Фермент смывают с колонки при 0,65 Г1 Г1аС1. Фракции по 2 мл, 10 содержащие Sfa N I, собирают, диализуют 20 ч против буфера С (0,02 M

К-фосфат, рН 7,5; 0,02 M KCl, 5,4

«10 М ЭДТА, О, 1 Г1 2-меркаптоэтанол, 50Х глицерин). 15

Определение активности фермента проводят следующим образом.

К 30 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкг ДНК фага Я С1857 (0,02 M трис-НС1, рН 7,5; 0,01 M MgC1<, 20

О, 15 Г1 NaC1), добавляют 1 мкл из соответствующих фракций при очистке фермента. Инкубацию ведут 60 мин при о

37 С. Продукты гидролиза анализируют электрофорезом в 1,7Х-ной агарозе в 25 трис-ацетатном буфере, рН 0,05 (0,5 Г1 трис-НС1, 0,2 Г1 ацетат натрия, 0,02 Г1

ЭДТА). Гель окрашивают бромистым этидием (5 мг/л), фотографируют в ультрафиолете через красный светофильтр 30+ (К-8 ). За единицу активности прини." мают количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК фага

g C1857 за 1 ч при 37 С.

Выход рестриктазы на 1 г биомассы составляет 600 е.а. Активность фермента 4000 е.а./мл.

Результаты сравнения известного и предлагаемого способов представлены в табл. 3. 40

Пример 3. Фермент получают по примеру 2, но культивирование ведут до оптической плотности 2,8 при длине волны 9 -=-600 нм. Выход биомассы

13 r. Выход фермента 610 е.а./1 г био- 45 массы, а его активность 4000 е.а./мл (табл.3).

Пример 4. Фермент получают по примеру 2, но культивирование ведут до, оптической плотности 1,0 при длине 50 волны 7 =600 нм. Выход рестриктазы

100 е.а./r биомассы.

Пример 5. Фермент получают по примеру 2 но концентрация КН РО4 в культуральной жидкости 27 Г/ле Вы- 55 ход биомассы 12,8 г, выход рестриктазы 200 е,а./г.

Формула изобретения

1442546

Таблица1 массы,,е.а.

150

Сильное закисление среды при

ОП до >1 о.е.

200

54

300

Активный рост

610

81

Культура не растет

Т а б л и ц а 2

Оптическая плот- Выход фермента, ность g =600 нм, е.а./г о.е.

0,62

100

100

1,00

2,4

600

2,8

610

3,2

100

4,0

100

Концентрация, г/л

Выход фер мента на

1 г биоКультуральная ха-. рактеристика

Активный рост до

ОПьоо 5

Наблюдается угнетение роста, стационарная фаза при ОПьоо =4 о. е.

1442546

Т а б л и ц а 3

Показатели по способу

Параметры извест- предланому гаемому

6,5

Выход фермента, е.а./л

4000

500

150

610

Активность фермента, е.а./мл 600

4000

Таблица 4

Концентра- Выход фер- Дополнительная ция трип- мента на характеристика тона, г/л 1 г,е.а.

500

Увеличение лагфазы роста

Стабильное

600 культивирование

600

Составитель Н.Ходаров

Редактор Н.Гунько Техред М.Дидык Корректор N.Äåì÷èê

Заказ 6355/23 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, .Ж-35, Раушская наб,, д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Выход биомассы с ,.1 л культуральной жидкости1 Г 3 3

Выход фермента на 1 r биомассы, е.а, Удорожание процесса культивирования