Способ определения антиоксидантной активности химических соединений

 

Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, в частности к медицинской биофизике, клинической фармакологии, биохимии, патофизиологии, и может быть использовано для определения прои антиоксидантной активности химических соединений. С целью повышения точности при одновременном расширении функциональных возможностей способа за счет одновременного определения прооксидантной активности определяют уровни спонтанной и индуцированной латексом диаметром 1,7 мкм хемилюминесценции нейтрофилов в присутствии исследуемых соединений и без них (сходный уровень), и при снижении уровней хемилюминесценции нейтрофилов в присутствии химических соединений относительно исходного определяют антиоксидантную активность исследуемых химических соединений, а при повышении уровней хемилюминесценции нейтрофилов в присутствии исследуемых соединений относительно исходного - прооксидантную активность. табл.1.

СО)ОЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) (su e С 01 Б 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТ((РЫТИЯМ

11РИ ГКНТ СССР (21) 42ф0139/28-14 (22) 07.07.87 (46) 30.12.89. Бюл. 1(48 (71) Челябинский государственный ме- дицинский институт (72) B.Е.Рябинин, А.В.Зурочка, P.È.Ëèâøèö и И.И.Долгушин (53) 612.015(088.8) (56) Биофизика, 1974, Р 2, с. 276279. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ (57) Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, в частности медицинской биофизике, клинической фармакологии, биохимии, пато физиологии, и может быть использовано для определения про- и антиоксидантной активности химических соединений.

Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, в частности к медицинской биофизике, клинической фармакологии, биохимии, патофизиологии, онкологии и иммунологии, и может быть использовано для медикобиологических исследований с целью определения про- и антиоксидантной активности различных химических соединений, Цель изобретения — повьппение точ— ности и селективности способа при одновременном расширении его функциональных возможностей.

Способ осуществляют следующим образом.

С целью повышения точности при одновременном расщирении функциональных возможностей способа sa счет одновременного определения прооксидантной активности опредеЛяют уровни спонтанной и индуцированной латексом диаметром 1,7 мкм хемилюминесценции нейтрофилов в присутствии исследуемых соединекий и беэ них (сходный уровень), и при снижении уровней хемилюминесценции нейтрофилов в присутствии химических соединений относительно исходного определяют антиоксидантную активность исследуемых химических соединений, а при повьппении уровней хемилюминесценции нейтрофилов в присутст-. вии исследуемых соединений относитель- » но исходного — прооксидантную активность. 1 табл.

Силиконизированные стеклянные флаконы с буфером, состоящим из физиологических концентраций NaC1 КС1, КН РО, Иа НРО, НЕРЕЯ, L-глутамина и глюкозы и применяемым для выделения клеток, добавляют 1 мл раствора, содержащего 50 мкг люминола, 0,1 мл нейтрофилов (10+-10 /мл), исследуемые химические соединения. Регистрацию хемилюминесценции (XM) осуществляют сразу после добавления препаратов в течение 1-4 мин на жидкостном сцинтилляционном счетчике Ь$-1800 (Весктап}. Для индукции ХЛ добавляют в среду инкубации 0,01 мл латекса (диаметр частиц — 1,7 мкм) и вновь

1532869 регистрируют ХЛ нейтрофилов. При этом вещество, снижающее спонтанную ХЛ от/ носят к антиоксидантам, а повышающее— к прооксидантам. В случае снижения

ХЛ активированных нейтрофилов при неизменной или увеличенной ХЛ интактных нейтрофилов устанавливают, что антиоксидантная активность связана с, подавлением фагоцитоза, 10

Пример 1. Ге таринизированную венозную кровь отстаивали в течение

,30 мин при 37 С, плазму наслаивали, íà двойной градиент фиколлверографи.,на (q 1,077, q = 1,093). После .30 мин центрифугирования при,1500 об/ ,/мин на границе двух градиентов образовалось кольцо нейтрофилов, которые удаляли, отмывали дважды в буфере,,содержащем физиологические концентра- 20 ции МаС1, КС1, KhzPO<, Na HPO,.

HEPES, L-глутамин и глюкозу (рН 7,4); центрифугировали с ускорением 1500 g

1 в течение 10 мин. Затем клетки ресус-! пендировали, доводили до концентрации 25

10 /мл и испольэовали для определения ХЛ. Жизнеспособность нейтрофилов оценивали по эксклюзии трипанового

1синего и во всех экспериментах она составляла 99-100Х.

В качестве прооксидантов использовали известные соединения: FeSOy(10 мкМ

Н О (0,01 мл ЭЖ раствора), мИ НАДФ Н.

В качестве антиоксидантов использовали глутатион (1 мМ) и среднемолекулярные пептиды (CMII) крови в количест. ве 20-40 мкг/мл. Кроме того, исследовали химические соединения с йеизвестной ранее оксидантной активностью: акридиновый оранжевый (0,002 мг/мл), 40 солкосерил (200 мкг/мл) и спиртовый экстракт плазмы крови (200 мкг/мл), Для выявления оптимальных режимов индуцированной ХЛ использованы раэличныс. активаторы — полистирольные моно- 45 дисперсные латексы ф 0,5; 1,0; 1,7;

2,11," 2,65 мкм, латекс 1,7 мкм с сорбированным ТяС., ревматоидный диаг- ностикум (латекс с сорбированным Х глобулином и опсонизированный зимозан (Sigma).

ХЛ измеряли в имп/мин. Интенсивность вспышки оценивали как отношение к ХЛ интактных нейтрофилов в услов55 ных единицах, общую сумму вспышки оценивали за все время исследования, среднее значение интенсивности вспышки оценивали в условных единицах, Полученные результаты свидетельствуют о том, что полистирольный латекс (ф 1,7 мкм) является наиболее оптимальным стимулятором ХЛ ыейтрофилов, так как максимальная вспышка ХЛ отмечается в 1-2 мин регистрации и амплитуда вспышки на него является наибольшей по сравнению с другими активаторами.

Ионы Fe + существенно стимулируют

2+ спонтанную и индуцированную ХЛ в 5,7 и 1,6 раз соответственно: НАДФН в

1,35 и 1,6 раз; Н О в 13,6 раэ стимулирует спонтанную ХЛ, несколько снижая индуцированную ХЛ; глутатион снижает спонтанную и индуцированную ХЛ в 3 раза; акридиновый оранжевый в 4 и 6 раэ соответственно; СПМ крови в

6 и 7 раз; солкосерил в 1,5 и 3 раза; спиртовый экстракт крови в 3 и 80 раз.

Пример 2. В таблице приведены данные о влиянии различных химических соединений на спонтанную и индуцированную латексом ХЛ нейтрофилов, выделенных из другой пробы крови, Оценивали светосумму свечения как средний результат интенсивности ХЛ за период наблюдения (имп/мин).

Про- или антиоксидантная активность химических соединений оценива-! лась в процентах как отношение светосуммы свечения нейтрофилов в присутствии исследуемых химических соединений к светосумме свечения интактных или активированных латексом нейтрофилов.

Предложенное техническое решение расширяет функциональные возможности способа путем определения не только антиоксидантной, но и прооксидантной активности (действие ионов Ге, Н О, СИП крови от обожженных животных). Расширение функциональных возможностей способа и повышение его селективности также демонстрируется возможностью дифференцированного подхода к изучению влияния химических соединений на спонтанную ХЛ интактных нейтрофилов и ХЛ, индуцированную латексом, т.е, сопряженную с фагоцитозом.

Возможность выявлять химические соединения, антиоксидантная активность которых связана с подавлением фагоцитоза (путем исследования уровней спонтанной и индуцированной латексом ХЛ нейтрофилов человека, в случае снижения ХЛ активированных нейтрофилов при неизменной или увеличенной ХЛ интактных нейтрофилов) яв1532869 6 рофилов устанавливают, что антиоксиь дантная активность химических соединений связана с подавлением фагоцитоэа.

Исследуемые химические соеди1О нения

Отношение

Отношение

Формула изобретения интенсивности ХЛакинтенсивности ХЛ нейтрофилов в присутствии химических соединений к ХЛ интивированных латексом,нейтрофилов в присутствии химитактных нейтрофилов, 7 ческих соединений к

ХЛ активированных латексом нейтрофилов, Х

96

39

32, 8

51,4

28,3

10,3

1,5

31,5

Составитель И.Гуляева

Техред Л. Олийнык Корректор Э.Лончакова

Редактор О.Спесивых

Заказ 8094/Ы

Тираж 789

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.ужгород, ул. Гагарина,101 ляется существенным преимуществом данного способа. Это дает возможност отбирать лекарственные средства с противовоспалительным действием, в частности препараты, влияющие на фа- гоцитоэ.

1. Способ определения антиоксидантной активности химических соединений путем введения исследуемого химического соединения в биологический объект, индукции свободнорадикаль " 1> ного окисления и оценки антиоксндантной активности по разнице интенсивности хемилюмииесценции в присутствии и отсутствие исследуемого соединения, отличающийся тем, что, с 20 целью повышения точности при одновременном расширении функциональных возможностей способа эа счет одновременного определения прооксидантной ак-, тивности, в качестве биологического 25 объекта используют нейтрофилы человека, измеряют хемилюминесценцию нейтрофилов и при снижении хемилюминесценции в присутствии исследуемого соединения определяют антиоксидантную активность, при повышении — прооксидантную активность.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ .и и с я тем, что, с целью повышения селективности способа, используют нейтрофилы человека, активированные

35 латексом, и в случае снижения хемилюминесценции активированных нейтрофилов на фоне неизменной или увеличенной хемилюминесценции интактных нейтFeS0 (10 мкИ) 330

О,ЗЖ НцО (0,01 мп) 805

Солкосерил (1 00 мкг) 66, 7

СМП иэ крови животных с термической травмой (10 мкг) 155

СМП иэ крови эдо» ровых животных (!О мкг) 16,5

Акридиновый оранжевый (0,002мг/л) 17,8

Спиртовый экстракт крови. (100 мкг) 35„1

Глутатион (1 мМ) 34,3