Ассоциированная вакцина против болезни ауески и чумы свиней и способ ее получения
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Целью изобретения является повышение иммуногенной активности и снижение реактогенности ассоциированной величины, а также повышение ее качества. Ассоциированная вакцина включает вируссодержащую сyспензию из штамма вируса болезни Ауески "ГНКИ" (депонированного в ВНКИ ветпрепаратов под ft 67А) и вируссодержащую суспензию из штамма вируса чумы свиней "К" (депонированного в ВГНКИ ветпрепаратов под N 67). В качестве стабилизатора вакцина содержит смесь желатины, сахарозы и фосфатного буфера. Способ изготовления ассоциированной вакцины включает раздельное культивирование штамма "ГКИ" вируса болезни Ауески в культуре клеток эмбрионов кур, а штамма К вируса чумы свиней - в культуре клеток почек плодов свиньи. После достижения необходимых титров вирусов в вируссодержащих суспензиях последние смешивают в соотношении 1:1 и добавляют стабилизатор. Ассоциированую вакцину против болезни Ауески и чумы свиней применяют для профилактики этих заболеваний в свиноводческих хозяйствах. 2 с. п. ф-лы, 3 табл.
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и, в частности, к ассоциированной вирусвакцине, используемой для профилактики болезни Ауески (БА) и классической чумы свиней (КЧС). Целью изобретения является повышение иммуногенной активности и снижение реактогенности ассоциированной вакцины против болезни Ауески и чумы свиней. П р и м е р 1. Ассоциированная вирусвакцина против болезни Ауески и чумы свиней включает вируссодержащие материалы из штамма вируса болезни Ауески ГНКИ (а. с. СССР N 323125, А 61 К 23/00) и штамма вируса чумы свиней К (а.с. СССР N 287741) и стабилизатор при следующем соотношении компонентов, вируссодержащий материал из штамма Pseudorables ГНКИ N 67А с титром инфекционной активности 4,5-5,0 lg ЛКД50/мл 32-34; вируссодержащий материал из штамма European swinefever К N 67 с титром 4,5-6,0 lg ИДК50/мл 32-34; стабилизатор остальное. Вакцинные штамм вируса болезни Ауески ГИКИ и штамм вируса чумы свиней К депонированы в коллекции вирусов Всесоюзного государственного, научно-контрольного института ветеринарных препаратов и имеют регистрационные номера 67А и 67 соответственно. Применяемый стабилизатор имеет следующий состав, Желатин 1,5 Сахароза 7,5 Фосфатный буфер, рН 7,0-7,2 Остальное При культивировании вирусов в качестве питательной среды используют среду, содержащую 0,5 гидролизата лактальбумина в растворе Хенкса. Способ изготовления ассоциированной вакцины против болезни Ауески и чумы свиней включает получение первично-трипсинизированных культур клеток эмбрионов кур (КЭК) и почек плода свиньи (ППС); подготовку посевного материала, в качестве которого используют матриксные вакцинные штаммы вируса болезни Ауески (ВБА) и классической чумы свиней (ВКЧС) с титром не ниже 4,0 lg ЛКД50/мл (ИДК50/мл), полученные в результате заражения монослоя клеток КЭК вирусом БА ГНКИ N 67А и монослоя клеток ППС штаммом вируса КЧС "К" N 67; подготовку и заражение производственной партии культуры клеток. Культуральные сосуды с растущей культурой клеток эмбрионов кур просматривают и отбирают с полностью сформировавшимся монослоем. Перед заражением из сосудов удаляют среду роста, монослой 1-2 раза промывают раствором хенкса, а затем вносят вакцинный штамм вируса болезни Ауески ГНКИ N 67А в дозе 1,0-10,0 ТЦД50/клетку. После 1-1,5 ч адсорбции добавляют поддерживающую среду и культивируют в течение 36-48 ч до получения инфекционной активности вируса 4,0-5,0. Аналогичным образом проводят заражение культуры клеток почек плода свиньи штаммом вируса чумы свиней "К" N 67, который вносят в дозе 0,15-0,4 ИКД50/клетку, выдерживают в течение 1,0 ч для адсорбции вируса, после чего в сосуды добавляют поддерживающую среду и культивируют в течение 4-5 дней до получения инфекционной активности вируса 4,0-5,0. ИКД50/мл. Полученные партии вируса ВБА и КЧС объединяют и смешивают с таким расчетом, чтобы конечная концентрация каждого возбудителя в общем объеме составила 4,0-5,0 lg ЛИД50/мл или ИКД50/мл соответственно. К объединенному в соотношении 1 1 объему вируссодержащих жидкостей добавляют стабилизатор (желатино-сахарозную среду) и антибиотики (пенициллин, стрептомицин), пеpeмeшивают и лиофилизируют. Вирусвакцину, ассоциированную против болезни Ауески и чумы свиней из штаммов "ГНКИ" и "К", применяют для профилактики этих заболеваний. Вакцину вводят животным внутримышечно двукратно с интервалом 25-30 дней в дозах 60-600 ЛКД50 (ИКД50). П р и м е р 2. Ассоциированная вакцина против болезни Ауески и чумы свиней из штамма BБA"ГHKИ" и штамма КЧС "К" содержит следующие компоненты в 1 л препарата. Вируссодержащий, содержащий минимум, максимум (мл) cоответственно: материал из штамма вируса болезни Ауески свиней "ГНКИ" N 67A, титр вируса 4,0-5,0 lg ЛКД50/мл, 320, З40; вируссодержащий материал из штамма вируса чумы свиней "К" N 67, титр вируса 4,0-5,0 lg ИКД N 320, 340; cтабилизатор 320, 360. П р и м е р 3. Определение оптимальных соотношений компонентов ассоциированной вакцины. Активность вирусов БА штамма "ГНКИ" и КЧС штамма "К" в моно- и ассоциированной вакцине изучают путем титрования в культуре клеток по цитопатогенному действию для ВБА, на кроликах (по гибели кроликов для ВБА и по температурной реакции для ВКЧС). Результаты сравнительного изучения активности вирусов в ассоциированной вакцине с разным соотношением компонентов и моновакцинах представлены в табл. 1. П р и м е р 3. Сравнительное изучение иммуногенной активности ассоциированной вакцины против болезни Ауески и чумы свиней и моновакцины против классической чумы свиней проводят на свиньях. Используют образцы ассоциированной вакцины, соотношение антигенов ВБА и КЧС в которых 1:10 10:1 1:1. Моновакцину против КЧС испытывают в 5 десятикратных разведениях. Результаты испытания представлены в табл. 2. П р и м е р 4. Сравнительное изучение ИМД50 моновакцины против БА и ассоциированной вакцины против болезни Ауески и чумы свиней проводят на овцах. Образцы ассоциированной вакцины, соотношение антигенов ВБА и КЧС в которой 1:1, 1:10 10:1, и моновакцину против болезни Ауески испытывают на иммуногенность на овцах. Готовят 5 десятикратных разведений вакцины и каждое разведение вакцины вводят овцам под кожу в дозе 1 мл. Результаты испытания представлены в табл. 3. Из табл. 1 3 видно, что все опытные серии ассоциированной вакцины с разными сочетаниями антигенов достаточно иммуногенны, однако лучшие результаты при соотношении вакцинных штаммов ВБА "ГНКИ" и ВКЧС "К" 1:1. Наличие двух антигенов в препарате не оказывает отрицательного влияния на иммуногенность ассоциированной вакцины. П р и м е р 5. Получение ассоциированной вакцины. Монослой первичной культуры клеток эмбрионов кур в 1 -литровых матрацах заражают вакцинным штаммом ВБА "ГИКИ" N 67А в дозе 1,0 ТЦД50/клетка и вносят 100 мл поддерживающей питательной среды. Культивирование вируса проводят при 36-37oС в течение 48 ч до полной деструкции клеточного слоя. Получают 100 мл вируссодержащего материала с инфекционной активностью вируса 4,5 lg ЛКД50/мл. Монослой первичной культуры клеток ППС в 1-литровых матрацах заражают культуральным штаммом ВКЧС "К" N 67 в дозе 0,15 ИКД50/клетки и вносят 100 мл поддерживающей питательной среды. Культивирование вируса проводят при 36-37oC в течение 4 сут, после чего суспензию замораживают при -40oС, а через 20 ч оставляют при комнатной температуре для оттаивания. Получают 100 мл вируссодержащего материала с инфекционной активностью вируса 4,5 lg ЛКД50/мл. Смешивают 100 мл полученной вируссодержащей суспензии из штамма вируса болезни Ауески "ГНКИ" N 67А, 100 мл вируссодержащей культуральной суспензии из штамма вируса чумы свиней "К N 67 и 100 мл стабилизатора, содержащего желатин и сахарозу в фосфатном буфере. К смеси добавляют 1 млн ЕД пенициллина и 1 мг стрептомицина. Полученную вакцину расфасовывают во флаконы. П р и м е р 6. Проводят раздельное культивирование вакцинных штаммов ВБА и ВЧС. С этой целью в культуральные сосуды с культурой КЭК вносят вакцинный штамм ВБА "ГНКИ" N 67А в дозе 5,0 ТЦД50/мл культивируют в течение 36 ч. В культуральные сосуды с культурой клеток ППС вакцинный штамм ВЧС "К" N 67 вносят в дозе 0,2 ИКД50/клетка и культивирование продолжают в течение 4 сут. Инфекционный титр полученных штаммов ВБА и КЧС на кроликах 5,0 lg ЛИЦ50/мл 5,0 lg ИКД50/мл соответственно. Для получения 1 млн доз ассоциированной вакцины компоненты смешивают в следующих количествах, л: Штамм ВБА "ГНКИ" N 67А с титром 5,0 lg ЛКД50/мл 3,3-13,5 в культуральной среде Штамм ВКЧС "К" N 67 с титром 5,0 lg ИКД50/мл в культуральной 13,3-13,5 среде Стабилизатор (желатино-сахарозная среда) 13,3-13,5 Полученную вирусвакцину расфасовывают в 20-миллиметровые флаконы по 6 мл и подвергают сублимационному высушиванию. П р и м е р 7. Культуру КЭК, выращенную в культуральном сосуде, заражают вакцинным штаммом ВБА "ГНКИ" N 67А, вирус вносят в дозе 5,0 ТЦД50. Через 42 ч культивирования определяют инфекционный титр ВБА, который составляет 4,5 lg ИКД50/мл. Культуру ППС, зараженную-вакцинным штаммом ВЧС "К" культивируют в течение 5 сут, после чего определяют титр инфекционной активности вируса, который соответствует значению 4. 4,25 lg ИКД50/мл. 340 МП вируссодержащей суспензии из штамма "ГНКИ" и 320 мл вируссодержащей суспензии из штамма "К" объединяют, к смеси добавляют З40 мл стабилизатора и антибиотики. Получают 1 л ассоциированной вакцины против болезни Ауески и чумы свиней. Приготовленную таким образом ассоциированную вакцину против болезни Ауески и чумы свиней применяют для иммунизации. Препарат вводят внутримышечно в разведении 1:50 в объеме 2,0 мл, содержащих 200 ИМД50, вакцины, двукратно с интервалом 20 25 дней. Изготовлено и испытано 7 опытных серий вирусвакцины, одна из которых изготовлена промышленным методом в условиях биокомбината. Состав вакцины, изготовленной в условиях биокомбината,
Штамм ИВА "ГНИЙ" 67А с титром 5,0 lg ЛКД50/мл в культуральной среде 34
Штамм ВКЧС N 67 с титром 4,75 lg ИКД50/мл в культуральной среде 32
Стабилизатор З4
П р и м е р 8. Комиссионное испытание ассоциированной вакцины, проведенное на 28 кроликах, 12 подсвинках и 10 овцах включает проверку антигенной активности; проверку реактогенности и безвредности; проверку иммуногенных свойств препарата. Антигенную активность ассоциированной вакцины испытывают на 28 кроликах массой 2,0 
0,1 кг. Десятикратные разведения вакцины от 10-3 до 10-5 вводят внутримышечно по 1 мл кроликам ( по 4 кролика на каждое разведение), активность вакцины определяют по гибели кроликов. Инфекционный титр обеих серий вакцины 5,0 lg ЛКД50/мл. Реактогенность и безвредность вирусвакцины испытывают на 6 подсвинках. Четырем подсвинкам вводят вакцину в объеме 2 мл внутримышечно в область шеи в разведении 1 10 (5-кратная прививочная доза). Двум контрольным подсвинкам вводят по 2 мл физиологического раствора. Температура тела трехвакцинированных и двух контрольных животных в пределах нормы, а у одного вакцинированного подсвинка на 10-й день после вакцинации зафиксировано повышение температуры тела до 40,1oС. В целом иммунизация свиней ассоциированной вирусвакциной не вызывает видимых признаков заболевания
Анализ гематологических показателей в группе опытных и контрольных подсвинков также показывает отсутствие существенных различий между группами в период после вакцинации. Иммуногенную активность двух серий вирусвакцины против вируса болезни Ауески проверяют на 10 овцах, против вируса классической чумы свиней на 7 подсвинках. Каждую серию вакцины в разведении 1:50 в объеме 1 мл вводят подкожно овцам в область внутренней стороны бедра и подсвинкам в объеме 2 мл внутримышечно в область шеи. Через 22 дня проводят контрольное заражение овец вирулентным штаммом ВБА в дозе 200 ЛД50, а подсвинков вирулентным штаммом ВЧС в дозе 5,0 ЛД50. Из восьми вакцинированных овец после контрольного заражения вирулентным штаммом вируса болезни Ауески ни одно животное не заболело при гибели двух контрольных на 6-7-й день. Из четырех вакцинированных подсвинков ни одно животное не заболело после вакцинации и последующего контрольного заражения при гибели всех 3 контрольных непривитых животных. Изучение динамики образования поствакцинальных антител показало, что после первой вакцинации вируснейтрализующие антитела к вирусам БА и КЧС на 14-й день в пределах 1:2-1:8, а к 21-28-мy дню 1:4-1:32, через 4 мес. средние показатели титров вируснейтрализующих антител 1:8, через 6 мес. 1:5. В течение 8 мес. наблюдения случаев заболевания болезнью Ауески в ранее неблагополучном по БА хозяйстве отмечено не было. П р и м е р 9. Испытание ассоциированной вирусвакцины в производственных условиях. Свиньям разных возрастов вводят ассоциированную вакцину в дозе 2 мл разведения 1:50 двукратно с интервалом 20-25 дней. Выборочно у свиней измеряют температуру тела в течение 10 дней после вакцинации. Результаты десятидневных наблюдений показывают, что общее клиническое состояние животных без изменений, но у 0,05% свиней отмечено кратковременное повышение температуры тела, что указывает на слабые реактогенные свойства ассоциированной вакцины Суибивак и ее безвредность. Проведенные испытания ассоциированной вакцины против БА и КЧС в опытах на животных показывают, что вакцина безвредна, слабореактогенна и обеспечивает формирование достаточно напряженного иммунитета к вирусам болезни Ауески и чумы свиней, длительность иммунитета 12 месяцев. Соотношение 1:1 антигенов вирусов БА штамма "ГНКИ" и КЧС штама "К" в составе вакцины является оптимальным при условии их идентичной активности на кроликах. Оптимальной стабилизирующей средой является желатино-сахарозная среда. По сравнению с известной вакциной, принятой в качестве прототипа, предложенная вакцина более активна и в то же время слабореактогенна; ведение препарата не вызывает осложнений. Способ изготовления вакцины отличается тем, что культивирование вирусов проводят в первичных культурах клеток, при этом используют простые и недорогие питательные среды. Контроль активности препарата проводят на кроликах. Применение ассоциированной вакцины против болезни Ауески и чумы свиней, вместо соответствующих моновакцин, позволит сократить затраты труда на проведение вакцинации. Кроме того, у животных, вакцинированных ассоциированным препаратом, иммунитет формируется в более короткие сроки по сравнению с животными, иммунизированными с применением монопрепаратов.
Формула изобретения
Вируссодержащая суспензия из штамма European swinefever Restivirus "К" N 67 с титром 4,5-5,0 ИКД 50/мл 32-34
Желатин 0,48-0,4
Сахароза 2,4-2,7
Фосфатный буфер, pH 7,0-7,2 остальное
2. Способ получения ассоциированной вакцины против болезни Ауески и чумы свиней, включающий раздельное культивирование вирусов болезни Ауески и чумы свиней в культуре клеток, смешивание полученных вируссодержащих суспензий, добавление стабилизатора, расфасовку и лиофилизацию препарата, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевого продукта, в качестве вируса болезни Ауески используют штамм Pseudorabies virus "ГНКИ" N 67А, а в качестве вируса чумы свиней штамм European swinefever Restivirus "К" N 67, при этом культивирование штамма Preudorabies virus "ГНКИ" N 67А осуществляют в культуре клеток эмбрионов кур при множественности заражения 1,0-10,0 ТЦД 50/клетку в течение 38-48 ч до конечного титра 4,5-5,0 АКД 50/мл, культивирование штамма European swinefever Restivirus "К" N 67 осуществляют в культуре клеток почки плода свиньи при множественности заражения 0,15-0,4 ИКД 50/клетку в течение 4-5 сут до конечного титра 4,5-5,0 ед ИКД 50/мл, а в качестве стабилизатора используют смесь желатина, сахарозы и фосфатного буфера при следующем соотношении компонентов, мас,
вируссодержащая суспензия из штамма Pseudorabies virus "ГНКИ" N 67 с титром 4,5-5,0 ед ЛКД 50/мл 32-45
вируссодержащая суспензия из штамма European swinefever Restivirus "К" N 67 с титром 4,5-5,0 ед ИКД 50/мл 32-34
желатин 0,48-0,54
сахароза 2,4-2,7
фосфатный буфер, рН 7,0-7,2 остальное
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 13.11.2004
Извещение опубликовано: 10.07.2008 БИ: 19/2008
