Способ культивирования микроорганизмов

 

Изобретение относится к промышленной микробиологии, касается способов культивирования микроорганизмов и может быть использовано в микробиологическом синтезе биологически активных веществ. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и сокращение времени культивирования. Изобретение заключается в том, что микроорганизм - продуцент выращивают в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду. В момент начала лимитирования биосинтеза кислородом в питательную среду вносят смесь оксиэтилированного полипропиленгликоля (проксанола), взятого в количестве 0,001 - 1 г/л, и источника углерода в количестве, пропорциональном увеличению скорости массопередачи кислорода. Изобретение позволяет на 42 - 50% повысить выход целевого продукта или его активность и на 20 - 33% сократить время культивирования. 7 табл.

Изобретение относится к промышленной микробиологии и касается способов культивирования микроорганизмов. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и сокращение времени культивирования. Способ осуществляют следующим образом. Перед проведением культивирования рабочий ферментер заливают раствором сульфита и определяют скорость массопередачи кислорода при рабочих условиях аэрации и перемешивания. Затем вносят определенное количество проксанола и вновь определяют скорость массопередачи кислорода. По полученным данным вычисляют увеличение скорости массопередачи кислорода в присутствии проксанола. Готовят питательную среду, содержащую источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, засевают ее культурой микроорганизмов, осуществляют периодическое культивирование при аэрации и перемешивании. Одновременно с этим готовят смесь проксанола с дополнительным источником углерода. Каждый из компонентов по отдельности стерилизуют, затем смешивают, причем проксанол берут в количестве 0,001-1 г/л питательной среды, а дополнительный источник углерода - в количестве, пропорциональном увеличению скорости массопередачи кислорода. Полученную смесь вносят в момент начала лимитирования биосинтеза кислородом. Изобретение поясняется примерами. П р и м е р 1. Осуществляют периодическое культивирование мицелиального гриба Trichoderma viride 13/10 на питательной среде состава (%): свекловичный жом 3,0 пшеничные отруби 0,5 солодовые ростки 1,43 КН₂РО₄ 0,2 (NH₄)₂SO₄ 0,4 MgSO₄ 0,03 NaNO₃ 0,4 Параллельно на той же среде культивируют Trichoderma viride 44. Культивирование проводят в колбах объемом 0,75 л на круговой качалке со скоростью перемешивания 220 об/мин при 28^оС. Изменение выхода целевого продукта оценивают по изменению целлюлолитической активности (гидролиз бумаги по Мандельс-Веберу). До начала культивирования сульфитным методом определяют изменение скорости массопередачи кислорода в качалке при внесении проксанола в количестве 0,001-1 г/л. Так, внесение 0,001 г/л проксанола приводит к увеличению скорости массопередачи кислорода по сравнению с контролем на 25% и соответственно перед внесением проксанола в питательную среду готовят смесь из 0,001 г/л проксанола и источников углерода, количество которых на 25% превышает первоначальное. Для внесения 0,01 г/л проксанола готовят смесь, состоящую из 0,01 г/л проксанола и источников углерода, количество которых в 2 раза превышает первоначальное. Оптимальный момент внесения смеси в питательную среду определяют, внося смесь сразу после посева культуры (нулевой час роста) и в момент начала лимитирования биосинтеза уровнем растворенного кислорода. Для указанных штаммов-продуцентов и приведенных условий культивирования лимит по кислороду наблюдают на 36 ч роста культуры. Варианты осуществления способа, а также известных способов и контроля (без внесения ПАВ) приведены в табл. 1, 2. Как видно из таблиц, внесение в питательную среду смеси проксанола П-268 и источников углерода в момент начала лимитирования биосинтеза кислородом позволяет повысить на 40-50% целлюлолитическую активность целевого продукта и на 23-24% сократить процесс биосинтеза (по сравнению с контролем). По сравнению с известным способом предлагаемый способ позволяет повысить целлюлолитическую активность продукта на 36% при снижении продолжительности процесса на 23%. Внесение смеси проксанола и источников углерода, количество которых не было пропорциональным увеличению скорости массопередачи кислорода, приводит к незначительному увеличению выхода целевого продукта и сокращению продолжительности процесса. П р и м е р 2. Периодическое культивирование Aspergillus foetidus 20-311 продуцентов пектолитических ферментов осуществляют на питательной среде состава (%): свекловичный жом 3,0
солодовые ростки 0,5
(NH₄)₂SO₄ 0,7
KH₂PO₄ 0,1
MgSO₄ 0,05
Параллельно осуществляют культивирование Aspergillus anamori 16 на среде того же состава. Культивирование проводят в колбах объемом 0,75 л на круговой качалке со скоростью перемешивания 220 об/мин при 30^оС. Изменение выхода целевого продукта оценивают по изменению пектолитической активности (интерферометрический метод). До начала культивирования сульфитным методом определяют изменение скорости массопередачи кислорода в качалке при внесении проксанола в количестве 0,001-1 г/л. Так, внесение 0,001 г/л проксанола приводит к 30% увеличению скорости массопередачи кислорода по сравнению с контролем. С учетом этого готовят смесь, состоящую из 0,001 г/л проксанола и источников углерода, количество которых на 30% превышает первоначальное. Для внесения 0,01 г/л проксанола готовят смесь, состоящую из 0,01 г/л проксанола и источников углерода, количество которых в 2 раза превышает первоначальное. Оптимальный момент внесения смеси в питательную среду определяют, внося смесь сразу после посева культуры (нулевой час роста), и в момент начала лимитирования биосинтеза уровнем растворенного кислорода. Для указанных штаммов - продуцентов и приведенных условий культивирования лимит по кислороду наблюдают на 24 ч роста культуры. Варианты осуществления способа по изобретению, а также известного способа и контроля (без внесения ПАВ) приведены в табл. 3,4. Таким образом, внесение проксанола в культуральную среду позволяет значительно повысить пектолитическую активность при снижении продолжительности процесса для обоих штаммов Aspergillus. П р и м е р 3. Периодическое культивирование дрожжей Candida maltoza ВСБ-569 осуществляют в 40-литровом ферментере с рабочим объемом 12 л на питательной среде состава, г/л:
Н₃РО₄ 32
(NH₄)₂SO₄ 250
KCl 80
MgSO₄ 44
FeSO₄ 3,48
ZnSO₄ 1,71
MnSO₄ 1,91 с парафинами нефти в качестве источника углерода в количестве 2 об.%. Засевная концентрация дрожжей - 0,8-1,5 г/л. Процесс ведут при 33-34^оС и поддержания рН среды в пределах 4,0-4,2 путем добавления 6%-ного раствора аммиачной воды. Перемешивание осуществляют самовсасывающей турбоэжекционной мешалкой со скоростью 300 об/мин. Расход воздуха составляет 6 м³/ч, отбор проб проводят со скоростью 2 л/ч. Критерием окончания процесса выращивания дрожжей служит снижение концентрации парафина в среде до 1 г/л и менее. До начала культивирования сульфитным методом определяют изменение скорости массопередачи кислорода в ферментере при внесении проксанола в количестве 0,001-1 г/л. Так, внесение 0,05 г/л проксанола приводит к увеличению скорости массопередачи кислорода по сравнению с контролем в 2,3 раза. С учетом этого готовят смесь, состоящую из 0,05 г/л проксанола и 4,6 об.% парафина. Для внесения 1,0 г/л проксанола готовят смесь, состоящую из 1,0 г/л проксанола и 4,4 об.% парафина. Оптимальный момент внесения смеси в питательную среду определяют, внося смесь сразу после посева культуры (нулевой час роста) и в момент начала лимитирования биосинтеза уровня растворенного кислорода. Для указанного штамма-продуцента и приведенных условий культивирования лимит по кислороду наблюдают на 4 ч роста культуры (см. табл. 5, варианты 6,7). Как видно из табл. 5, внесение в питательную среду смеси проксанола П-268 и парафина в момент начала лимитирования биосинтеза кислородом позволяет на 42% повысить выход целевого продукта при уменьшении продолжительности процессов на 33% (по сравнению с контролем). Внесение смеси проксанола и парафина, количество которого не пропорционально увеличению скорости массопередачи кислорода, не приводит к увеличению выхода целевого продукта и сокращению продолжительности процесса. Кроме того, осуществление процесса культивирования дрожжей по предлагаемому способу позволяет значительно улучшить все важнейшие показатели роста дрожжей. Так, содержание остаточных углеводородов в культуральной жидкости снижается на 63% по сравнению с контролем, что свидетельствует о наиболее полной утилизации субстрата дрожжами. Концентрация абсолютно сухих дрожжей возрастает на 42%. П р и м е р 4. Культивирование бактериальных штаммов Bacillus subtilis 72 и Bacillus subtilis 103 осуществляют параллельно в 15-литровых ферментерах фирмы "Биолафит" на 8% крахмала. Крахмал предварительно осахаривают, для чего 12 кг крахмала разводят в 16 л и получают крахмальное молоко, в которое вливают 0,5 л раствора, состоящего из 48 г амилазы и 6 г карбоната кальция. Затем 14,5 л воды нагревают до 90^оС и при перемешивании в раствор вливают все приготовленное крахмальное молоко. Температуру в биореакторе поддерживают на уровне 85^оС в течение 3 ч. По окончании осахаривания доводят объем раствора до 40 л и рН до 2,5 фосфорной кислотой. В ферментер вливают 4,4 л осахаренного крахмала, добавляют 30 г сухого гидролизата дрожжей, 22,5 г хлорида калия, 7,5 г сульфита магния, 1,5 г хлорида кальция, 60 мл пеногасителя. Стерилизацию раствора осуществляют при 121^оС в течение 2 ч. После охлаждения до 45^оС в среду стерильно вливают кукурузный экстракт. Экстракт готовят следующим образом: в колбу вносят 180 г (NH₄)HPO₄ и 120 г кукурузного экстракта и доводят объем до 1 л. рН до 7,3-7,5 фосфорной кислотой. Стерилизуют экстракт при 121^оС 2 ч. Перед посевом среду в ферментере перемешивают и аэрируют в течение часа. Посев чистой культурой осуществляют при 45^оС. В течение 6 ч после засева постепенно снижают температуру до 37^оС и поддерживают ее на этом уровне. Культивирование проводят при скорости вращения мешалки 500 об/мин, рН поддерживают при получении нейтральной протеиназы на уровне 5,6, а при получении амилазы - на уровне 6,1-6,3 добавлением стерильного NH₄OH. В течение культивирования периодически через каждые 6 ч отбирают пробы, которые анализируют на протеолитическую или амилолитическую активность. В процессе культивирования в культуральную жидкость вносят смесь проксанола с источниками углерода. Результаты исследований приведены в табл. 6. Из таблицы следует, что внесение проксанола в питательную среду позволяет значительно повысить протеолитическую (амилолитическую) активность штаммов B.subtilis 72 и В.subtilis 103 при снижении продолжительности процесса. П р и м е р 5. Способ осуществляют в соответствии с примером 1 при культивировании продуцента целлюлолитических ферментов Trichoderma viride 13/10, при этом варьируют количество дополнительно вносимого в культуральную жидкость источника углерода, который вводят совместно с проксанолом или без него. Результаты представлены в табл. 7. Из представленных данных следует, что дополнительное внесение в среду источника углерода без проксанола к улучшению показателей процесса не приводит. Целесообразно вносить в среду проксанол совместно с источником углерода, причем количество последнего должно быть пропорционально увеличению скорости массопередачи кислорода в среде. Таким образом, изобретение позволяет повысить активность или выход целевого продукта на 42-50% и сократить продолжительность процессов на 20-33% .

Формула изобретения

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли и воду с внесением неионогенного ПАВ, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и сокращения времени культивирования, в качестве неионогенного ПАВ используют оксиэтилированный полипропиленгликоль в количестве 0,001 - 1 г/л, который смешивают с источником углерода, взятым в количестве, пропорциональном увеличению скорости массопередачи кислорода, а внесение полученной смеси в среду осуществляют в момент начала лимитирования биосинтеза кислородом.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 8-2000

Извещение опубликовано: 20.03.2000        

---