Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к j @ м рогатого скота

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в ветеринарии. Цель изобретения - повышение специфичности моноклональных антител (монАТ). Штамм гибридных клеток мышей получен при слиянии миеломных клеток РЗХ63-AG8. 653 со спленоцитами мышей BALB/C, иммунизированных JG M рогатого скота, и депонирован под номером ВСКК(П) N 166Д. Штамм продуцирует монАТ, специфически реагирующие с JG M рогатого скота, перекрестная реактивность с JGG и JGA не выявлена. МонАТ выявляются в реакции диффузионной преципитации (РДП) и в иммуноферментном тесте (ИФА). Титр специфических антител в культуральной жидкости составляет в РДП 1:8-1:16, в ИФА 0,5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">3</SP>-1<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">3</SP>. Штамм перевивается мышам BALB/C праймированным пристаном в виде асцитных опухолей, титр специфических антител в которых составляет в РДП 1:160-1:640, в ИФА - 0,5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">6</SP> - 1<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">6</SP>. МонАТ, продуцируемые штаммом, используются для иммунохимического выявления JGM и приготовления иммуноферментного конъюгата для диагностики специфического JGM. 1 табл.

СО103 СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСИИХ

СПУБЛИН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4229427/30-13 ,(22) 15.04,87 (46) 30.04.90. Бюл. Ô 16 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.P.Коваленко (72) Ю,Н.Федоров, В.K.Сологуб, Т,А.Феоктистова, И.Ю.Ездакова, Т.В.Буларгина и А.Г.Катруха (53) 578.085. 23(088. 8) (56) Zaane D.V. et а1.-,1 of Tnnnnnology Methods, 1984, 72, р. 427-441. (54) IIITAMN ГИБРИДНЫ(КУЛЬТИВИРУЕ11ЫХ

IQIET0K ЖИВОТНЫХ NUS 1П1$СШ Ц$, ИСПОЛЬЗУЕМЫИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К IgM РОГАТОГО Сl(ОТА (57) Изобретение относится к гибридомиой технологии и может быть использовано в ветеринарии. Цель изобретения — повьппение специфичности моноклональных антител (монАТ), Штамм гибридных клеток мышей получен при слиянии миеломных клеток РЗХ63-Ag8.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в ветеринарии.

Цель изобретения — повьппение специфичности моноклональных антител.

Штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток миеломы мьнпей

РЗ/Х63-Ag 8.653 с клетками селезенки мышей BaLB/ñ, иьпгунизированных 3кратно 100 мкг препарата Ig М овец и крупного рогатого скота.

Сливание клеток проводят через 3 дня после последней иммунизации с помощью ПЭГ-1000. 1(летки миеломы и

„„Я0„„3 560549 А 1 (5I)g С 12 N 5/00, А 61 K 39/395

653 со спленоцитами мышей BALB/c иммунизированных IgN рогатого ската, и депонирован под номером ВСКК(П)

Ф 166Д. Штамм продуцирует монАТ, специфически реагирующие с IgN рогатаго скота, перекрестная реактивность с Ig G u Ig А не выявлена.

МонАТ выявляются в реакции диффузионной преципитации (РДП) и в иммуноферментном тесте (ИФА). Титр специфических антител в культуральной жидкости составляет в РДП 1:8-1:16, в

ИФА 0,5 10З-1 .10, Штамм перевивается мышам ВА1 В/с праймированным пристаном в виде асцитных опухолей, титр специфических антител в которых сос- а ф тавляет в РДП 1:160-1:640, в ИФА—

0,5 .10 — 1 .10. . МонАТ, продуцируемь1е е штаммом, используются для иммунохимического выявления Ig И и приготовления иммуноферментного канъюгата для диагностики специфического Ig И.

I табл. спленоциты смешивают в соотноыении

1:10. Селекцию гибридом проводят на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибриды выращивают на 96-луночных платах на среде ДИЭМ с 107 фетальной сыворотки в атмосфере с 5И СО, Тестирование гибридом на продукцию антител проводят методом радиальной иммунодиффузии с использованием овечьей:сыворотки, а также иммуноферментным методом с использованием антиьпппиных конъюгатов, препаратов IgN 1

1560549 овец, Igtt крупного рогатого скота .(KPC) и IgG 1".РС.

Реклонирование проводят в полужидком агате — 1% а также методом лимио у

5 тирующих разведений на плашках. Б результате отобран и, размножен клон, продуцирующий моноклональные антитела (монАТ), которые образуют кольцо преципитации с овечьей сывороткой и положительны на Igtf 1(PC и овец в им муноферментном тесте, перекрестные реакции с IgG не наблюдаются

Положительный клон клеток последовательно размножали в 96- 24- и 12луночных платах, а затем в культуральных матрасах (100 мл).

Полученный штамм обозначен как

11иИ.РС.Ц-20, депонирован под номером

ВСКК (П) t» 166Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования — на среде ДИЕ11 или. RPt1- 1640 с

107 эмбриональной сыворотки КРС или 25 лошадиной сыворотки, 1 мИ пирувата натрия, 2% глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Стационарная суспензия.

Клетки перевивают через 2-5 дней с заменой не менее 507. ростовой среды, коэффициент рассева 1:3 — 1:5. Посевная доза (0,3-0,5) <10 кл/мп.

Культивирование в организме животного, При внутрибрюшинном введении штамма

35 в количестве 10 -10 кл/мьппь мышам линии ЗАЕВ/С вызывает образование асцит а, Характеристика полезного продукта, штамм продуцирует монАТ .класса

Т8С мыши, специфичные к IgM.ðîãàòîãî скота, не реагирующие с IgA и С.

Продуцируюцая активность.

В культуральной жидкости монАТ накапливаются в титрах 1:500 — 1:1000 (ИАФ) или 1:8 — 1:16 (РДП вЂ” реакция диффузионной преципитации).

В. асцитной жидкости титры в ИФА

0,5 (10 -10 ), в РДП 1:160 — 1;640m

Контаминация, 21икоплазмы, бакте50 рии, плесневые грибы и дрожжи не выявлены, Крио консервирование. Среда для з амораживания: 45% среды Игла, 457 эмбриональной сыворотки к,р.с., 107

ДИСО, Режим замораживания до -30 С о 55 со скоростью 1 град/мин до -ЗООС со скоростью 2 град/мин, далее — жидкий азот. Раэмораживают при 40 С, центрифугируют при 1000 об/мин в течение

10 мин, ресуспендируют в ростовой среде до концентрации 0,5" 10 кл/мл.

Использование штамма и продуцируемых монАТ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Клетки клона пассируют на среде Дульбекко с 10% сыворотки эмбриона коровы, 1 м11 пирувата натрия в атмосфере 5% СО .

Титр специфических антител в культуральной жидкости в РДП составляет

1:8 — i:16, в иммуноферментном тесте

1:500 — 1:1000.

Пример 2, 1 летки клона вводят в брюшную полость мьппам линии

ВА1.В/с, предварительно эа 7 сут праймированным 0,5 мп пристана, по

2 х10 клеток в 0,5 мл фосфатно †солевого раствора, На 16 сут получена асцитическая жидкость, титр специфических антител в ней составляет в РДП 1:600 — 1:640, в ИФА (1:500) х 10 — 1 «10

Пример 3, Гибридомную жидкость, содержащую специфические анти

«gM-антитела с титром в РДП 1:8, используют для определения IgM в сыворотках крови КРС методом 11анчини.

1 мл культуральной жидкости используют дпя приготовления 10 мл 1,2%-,ного агара (на стекло) для исследования

48 образцов сыворотки методом радиальной иммунодиффуэии. Вокруг лунок при наличии IgM в образцах сыворотки через 2 сут образуется четкое кольцо преципитации, диаметр которого увеличивается и сравнивается со стандартным образцом для определения количества IgM.

H p и м е р 4. Препараты монАТ, полученные из асцитной и культуральной жидкости высаливанием сульфатом аммония 507.-ного насыщения, конъюгированы перйодатным методом с пероксидазой из хрена в соотношении

1:I (вес/вес). Рабочее разведение конъюгата в ИФА с использованием в качестве антигеча Igtl КРС (10 мкг/лунку) 1: 1000. Реакция íà IgG u IgA крупного рогаТого скота в иммуноферментном тесте — на уровне контроля с неспецифическим белком.

Характеристика 11иИ РСЦ-20 по классу продуцируемых антител, их специфичности и активности в серологических тестах представлена в таблице, 20

КлассоСлелнфнчность

Продукция гамма-глобулннов, мгlмл

Активность вая лринадлеаК Ig класса

Видовая льтуральная вндкость ность

Кул ь- А слит туральная моноклональнык M С А овна крыса коза олен антител

ФА P/lll

ИФА РДП лочелонадь век ннд кость

0,2- 2,0- 1:160- 1:2- 0,3- 1:3200,3 3,0 1:б40 I: 32 2 .1О 1:2360

РВС +

Составитель Г,Смирнова Редактор Л.Веселовская ТехредЛ.Олийнык -- Корректор С.Шекмар

Подписное

Тираж 498

Заказ 951

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 156

Пример 5. В лунки полистироловых плат вносят rro 100 мкл препарата иммуноглобулинов — IgM, IgG, IgA на фосфатном буфере при рН 7,2 с содержанием белка 500 мкг/мл и одно- временно вносят в другой ряд лунок растнор 33СА той же концентрации, Проводят адсорбцию при 37 С в течение

2 ч. После 3-разового отмывания раствором 0,05Х-ного твина-20 на фосфатно-солевом буфере в каждый ряд лунок вносят по 1000 мкл гибридомной жидкости, инкубируют 18 ч при 4 С. После

6-кратного отмывания моющим раствором в лунки вносят по 100 мл антимышиного коньюгата с пероксндазой в оптимальном.разведении. Инкубируют 2 ч при 37 С, тщательно отмывают платы о моющим раствором (6 раз) и добавля1от по 100 мкл в лунку субстратной сме0549 6 си — Ов087-ный раствор 5-аминосалициловой кислоты с 0,0057 1120о, рН5,8.

Через 30 мин производят визуальный учет реакции по образованию коричневого окрашивания, Окрашивание наблюдается только в ряду лунок с адсорбированным IgH рогатого скота до раз" ведения 1: 320 — 1:640.

Использование нового штамма гибридомы позволит получить моноклональные антитела высокой специфичности, обладающие преципитирующими свойствами.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (П) N 166 Д, используемьп1 для получения моноклональных антител к IgM рогатого скота.