Способ получения экзогенного активатора протеина с

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения активатора протеина С из яда щитомордника, способного к превращению протеина С плазмы крови в активную форму, протеин CA. Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в следующем: яд щитомордника растворяют в растворе 0,19 - 0,21 М ацетата аммония и очищают методом гель-фильтрации на сефадексе G-100. Фракции, содержащие активатор протеина С, разбавляют в 2 раза водой и устанавливают PH 7,8 - 8,0. Раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,09-0,10 М ацетатом аммония с PH 7,8 - 8,0 и элюируют линейным градиентом ионной силы раствора ацетата аммония от 0,09 - 0,10 до 0,90 - 1,00 м, PH 7,8 - 8,0. Фракции активатора протеина С собирают и высушивают при помощи лиофилизации дважды. Выход целевого продукта по белку 1,5%, удельная активность 1500 ед/мг.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

М Ю

РЕСПУ БЛИН щ) С 12 N 9/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕНИЫЙ НОМИТЕТ

00 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГИНТ СССР

1 (21) 4412523/31-13

1 (22) 18.04.88 I (46) 23,05.90. Бюл. № 19 (71) Институт химической и биологической физики АН ЭССР (72) А.А.Тара, А.А.Аавиксаар, А.Е.Коган и С.М.Струкова (53) 577. 15.07 (088.8), (56) Klein I.D., Valker F.J. РигНй.cation of à Protein С Activator from

the Venon of the Southern Copperhead

° Snake (Agkistrodon с.с.). — Biochemistry, 1986, v. 25, № 15, р. 41754179.

Stocker К. at al. Characterization ой the Protein С Activator

Protec from the Venom of Southern

Copperhead (Agkistrodon с.с.) Snake. — Toxicon, 1987, v. 25, ¹ 3, р. 239-252. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЭОГЕННОГО

АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С (57) Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения активатора протеина С иэ ядра щитомордника, способного к превращению профермента протеина С плазмы крови в активную форму, протеинСа.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

Яд щитомордника (Agkistodon halys или Agkistodon blomhoffi) растворяют

„.Я0„„1565889 А 1

2 получения активатора протеина С из яда щитомордника, способного к пре- ( вращению протеина С плазмы крови в, активную форму — протеин Са. Целью изобретения является упрощение способа и повьш ение выхода целевого продукта. Способ заключается в следующем: яд щитомордника растворяют в растворе О, 19-0,2 1 М ацетата аммония и очищают методом гель-фильтрации на сефадексе G-100. Фракции, содержащие активатор протеина С, разбавляют в 2 раза водой и устанавливают рН 7,8-8,0. Раствор наносят на колонку. с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной

0,09-0,10 М ацетатом аммония с рН 7,8-8,0, и элюируют линейным градиентом ионной силы раствора ацетата аммония от 0,09-0,10 до О, 90-1, 00 М при рН 7,8-8,0. Фракции активатора протеина С собирают и высушивают при помощи лиофилизации дважды. Выход целевого продукта по белку 1,5Х, удельная активность 1500 ед/мг. в растворе О, 19-0, 21 M уксуснокислого аммония, центрифугируют при

5000 об /мин при 4 С в течение 30 мин, осадок отбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель-фильтрации.

Гель-фитрацию проводят на сефадексе

G-100 в растворе О, 19-0, 21 M уксуснокислого аммония. Фракции первого белкового пика, содержащие активатор протеина С, объединяют, разбавляют в два раза бидистиллированной водой и устанавливают рН 7,8-8,0. Раствор наносят на колонку DEAR-целлюлозы, 1565889! ° уравновешенную 0,09-0,10 И раствором уксуснокислого аммония, рН 7,8-8,0.

Часть белка проходит анионит, а ак.тиватор протеина С связывается с

DEAE-целлюлозой при рН 7,8-8,0, и ,.его элюируют линейным градиентом ионной силы раствора уксуснокислого аммония от 0,09-0 10 до 0,90-1,00 И (рН 7,8-8,0). Фракции активатора протеина С собирают и высушивают при помощи лиофилизации дважды.

Выход целевого продукта по белку 1,5X. Удельная активность активатора протеина С 1500 ед/мг.

За единицу активности активатора протеина С принимают количество пре парата, которое эа 1 мин при 37 С и рН 8,0 активирует 1 мкмоль протеина С °

В исходном материале, в ядре щи. томордника, невозможно количественно определить активность активатора протеина С, так как яд содержит актив-. ные протеиназы, которые интенсивно 25 гидролизуют субстрат„ активированного протеина С. Поэтому невозможно рассчитать степень очистки препарата активатора протеина С и его выход по активности.

Полученный согласно способу препарат активатора протеина С из яда щитомордника активирует протеин С, о чем судят по быстрому появлению эстеразной и амидаэной активности протеина С и по удлинению времени свертывания плазмы крови после добавления в нее активированного протеина С. Инкубация активатора с плазмой крови также приводит к удлинению тромбопластинового времени плазмы.

Эффект пропорционален времени инкубации смеси до инициации свертывания.

Препарат активатора не свертывает

0,3%-ный раствор фибриногена, не обладает тромбиноподобной (активаторной) активностью по отношению к факторам Ч и UIII и не инактивирует их, не обладает фактор Х-подобной актив.ностью по отношению к 0,01Õ-ному раствору протромбина, не активирует плазминоген и не обладает фибринолитической (плазменно-подобной) активностью. Таким образом, препарат является селективным и эффективным активатором протеина С, так как не активирует другие белки при их физиологической концентрации.

0

0

° 50

Препарат можно использовать в качестве экзогенного активатора протеина С в определении его функциональной активности в крови.

Пример 1. К 1,0 r яда щитомордника добавляют 5 мл 0,19 М раствора уксуснокислого аммония, смесь медленно перемешивают в течение 4 ч о при 4 С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин, Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель-фильтрации. Гель-фильтрацию проводят на колонке сефадекса G-100 тонкий, размеры колонки 3,0 150 см.

Колонку элюируют О, 19 И раствором уксуснокислого аммония со скоростью

30 мл/ч и собирают фракции по 15 мл.

Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорд-11" ° Получают три белковых пика. В первом пике фракции, которые имеют активность активатора протеина С, объединяют, разбавляют в два раза бидистиллированной водой и устанавливают рН 7 8. Раствор активатора наносят на уравновешенную 0,09 М раствором уксуснокислого аммония при рН 7,8 колонку DEAE-целлюлозы (2,4 25 см) и элюируют со скоростью

35 мл/ч до равновесия 0,09 М раствором уксуснокислого аммония при рН 7,8.

Затем элюируют колонку линейным градиентом ионной силы раствора (550+550 мл) уксуснокнслого аммония от 0,09 до 0,90 M при рН 7,8. Фракции по 15 мл, содержащие активатор протеина С, объединяют (150 мл) и лиофилнзируют дважды, Выход 16,2 мг (1,62Х по белку).

Удельная активность активатора

1590 ед/мг.

Пример 2. К 1,0 r яда щитомордника добавляют 5 мл 0,20 M раствора уксуснокислог0 аммония, перемешивают в течение 4 ч при 4 С. Растворенный яд центрифугируют при

5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин.

Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель-фильтрации на колонке (30 150 см) сефадекса

G-100. Колонку элюируют 0,20 M раствором уксуснокислого аммония,со скоростью 30 мл/ч и собирают фракции по 15 мл. В первом пике фракции, которые имеют активность активатора протеина С, объединяют, разбавляют в два раза водой н устанавливают

Формула изобретения

Составитель А.Семенов

Техред M,Äèäûê

Корректор Э.Лончакова

Редактор И.Дербак

Тираж 479

Подписное

Заказ 1199

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35» Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

5 15 рН 7,9. Раствор активатора наносят на уравновешенную О, 10 М раствором уксуснокислого аммония при рН 7,9, колонку DEAR-целлюлозы и элюируют до равновесия этим же раствором. За- тем элюируют колонку линейным градиентом ионной силы раствора (550 +

+ 550 мп) уксуснокислого аммония от

О, 10 до 0,95 М при рН 7,9. Фракции по 15 мп, содержащие активатор протеина С, объединяют (150 мл) и лиофилизируют дважды.

Выход 16,4 мг (1,643 по белку).

Удельная активность активатора

1575 ед/мг.

Пример 3. К 1,0 r яда щитомордника добавляют 5 мп 0,21 М раст-, вора уксуснокислого аммония перемео шивают s течение 4 ч при 4 С, Растворенный яд центрифугируют при

5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин.

Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель-фильтрации на сефадексе С-100. Колонку элюируют 0,21 М раствором уксуснокислого аммония со скоростью 30 мл/ч н собирают фракции по 15 мл. В первом пике фракции, которые имеют активность активатора протеина С, объединяют, разбавляют в два раза водой и устанавливают рН 8,0. Раствор активатора наносят на уравновешенную

О, 10 И раствором уксуснокислого аммония при рН 8,0 колонку DEAE-целлюлозы до равновесия этим же раствором.

Затем элюируют колонку линейным гра65889 6 диентом ионной силы раствора (550 +

+ 550 мп) уксуснокислого аммония от

0; 10 до 1 ° 00 М при рН 8,0. Фракции

5 по 15 мп, содержащие.активатор протеина С, объединяют (150 мп) и лиофилизируют дважды, Выход 15,7 мг (1,57Х по белку).

Удельная активность активатора

1640 eg/ .

Способ получения экзогенного активатора протеина С, включакщий растворение змеиного яда в буферном растворе, очистку полученного раст» вора колоночной хроматографией и лйофильное высушивание очищенного раст20 вора, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, в качестве змелного яда используют яд щитомордника, растворение ведут в буферном растворе ацетата аммония с концентрацией О, 19-0,21 И, очистку проводят на сефадексе С-100 и после этого фракции, содержащие активатор протеина С, смешивают с водой в со30 отношении 1: 1, устанавливают рН 7, 88,0, подвергают очистке колоночной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, элюируя продукт градиентом .концентрации ацетата аммония от 0,09-0, 10 до 0,90-1,0 И при рН 7,8-8,0 с последующим двукратньпч лиофильным высушиванием. !