Способ получения вещества, обладающего фибринолитической активностью и/или активностью активатора плазминогена

 

Изобретение относится к области медицины , в частности, к способам получения фибринолитических энзимов. Целью изобретения является повышение фармакологической чистоты целевого продукта. Для этого при культивировании в среде MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM EAGLE, содержащей 10% фоетальной бычьей сыворотки, 0,001% TWEEN-80 и 20 мМ буферного раствора HEPES, используют линию клеток GPK(CUCMI -222) или BEB (CUCMI- 221), культивацию проводят до концентрации 1,4<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">1</SP>° клеток, затем среду отделяют, клетки заливают средой, не содержащей сыворотку, и повторно культивируют. Отбирают среду, освобождают от клеток и центрифугируют в течение 30 мин при 40000 G, супернатант концентрируют, пропускают через колонку, заполненную агарозой хелата цинка и предварительно уравновешанную 0,02 M раствором трис-соляной кислоты PH 7,5, содержащим 1М хлорида натрия и 0,01% TWEEN-80. Затем элюируют белки линейным градиентом от 0 до 0,05 М имидазолом, отбирают активные фракции, вводят их в колонку, заполненную конканавалином -А-агарозой и уравновешанную 0,01М раствором фосфата натрия рН 7,5, содержащим 1М хлорида натрия и 0,01% TWEEN-80. Вновь проводят элюцию линейным градиентом 0,01М раствором фосфата натрия, содержащим 0,6 М альфа-Д-метилманнозида, 2М роданида калия, 0,01% TWEEN-80, вновь собирают активные фракции, к ним добавляют роданид калия до концентрации 1,6 М. Полученный раствор диализируют через твердый полиэтиленгликоль, затем центрифугируют, супернатант пропускают через колонку, заполненную сефадексом G-150 в буферном растворе 0,01М сульфата натрия рН 7, 5, содержащем 1, 6 М роданида калия и 0,01% TWEEN-80, затем целевой продукт элюируют и концентрируют диализом на полиэтиленгликоле. Полученный энзим характеризуется молекулярной массой в восстанавливающих условиях 62000±3000, а в невосстанавливающих 56000±2000, величина изоэлектрической точки равна 4,6 ед. Способ позволяет получить вещество, обладающее фибринолитической активностью и/или активностью активатора плазминогена с более высокой фармакологической чистотой. 2 ил., 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTY е 3

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР! (21) 3664932/28-14 (22) 04.11.83 (31) 8206575 (32) 05,03.82 (33) СВ (46) 07.09.89. Бюл. ¹ 33 (71) Паблик Хелт Лаборатори Сервис

Борд и Юниверсити Колледж, Лондон (СВ) (72) Энтони Аткинсон, Эсгар Электриквала, Джон Брайан Гриффитс, Эми

Латтер, Патрик Энтони Райли и Петер Морган Саттон (СВ) (53) 615.45 (088.8) (56) Ryken D.Ñ. and Collen D. J. Biol.

Chem. 1981, 256, 13, 7035-7041. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ BEIgECTBA, ОБЛАДАЮЩЕГО ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТЬЮ И/ИЛИ АКТИВНОСТЬЮ АКТИВАТОРА

ПЛАЗМИНОГЕНА (57) Изобретение относится к области медицины, в частности к способам получения фибринолитических энзимов.

Целью изобретения является повышение фармакологической чистоты целевого продукта. Для этого при культивировании в среде Minimum Essential Medium Eagle, содержащей 10Х фоетальной бычьей сыворотки, 0,0017 Tweem-80 и 20 мМ буферного раствора НЕРЕЯ, используют линию клеток GPK (cucmi-222) или ВЕВ (cucmi-221), культивацию проводят до концентрации

1,4 «10 » клеток, затем среду отделяют, клетки заливают средой, не содержащей сыворотку, и повторно культивируют. Отбирают среду, освобождают от клеток и центрифугируют в течение 30 мин при 40000g, суперна„„SU„„1 07204 А3

t5D 4 А 61 К 37/48 // С 12 N 9/50 таит концентрируют, пропускают через колонку, заполненную агарозой хелата цинка и предварительно уравновешанную 0,02 M раствором трис-соляной кислоты рН 7 5, содержащим 1М хлорида натрия и 0,017 Тътееп-80. Затем элюируют белки линейным градиентом от 0 до 0,05 М имидазолом, отбирают активные фракции, вводят их в колонку, заполненную %онканавалином-А-агарозой и уравновешенную 0,01М раствором фосфата натрия рН 7,5,ñîдержащим 1М хлорида натрия и 0,01Х

Tween-80. Вновь проводят элюцию ли нейным градиентом 0,01М раствором фосфата натрия, содержащим 0,6 М альфа-D-метилманнозида, 2М роданида калия, 0,012 Тчееп-80,вновь собирают активные фракции, к ним добавляют роданид калия до концентрации 1,6 М.

Полученный раствор диализируют через твердый полиэтиленгликоль, затем центрифугируют, супернатант пропускают через колонку, заполненную сефадексом G-150 в буферном растворе

0,01М сульфата натрия рН 7» содержащем 1,6 M роданида калия и 0,01Х

Tween-80, затем целевой продукт элюируют и концентрируют диализом на полиэтиленгликоле..Полученный энзим характеризуется молекулярной массой в восстанавливающих условиях 62000 +

+ 3000, а в невосстанавливающих

56000+2000, величина изоэлектрической точки равна 4,6 ед. Способ позволяет получить вещетво, обладающее фибринолитической активностью и/или активностью активатора плазминогена сболее высокой фармакологической чистотой. 2 ил., 3 табл.

1507204

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения фибринолитических энэимов.

Целью изобретения является повыше5 ние фармакологической чистоты целевого продукта.

На фиг.1 показана фибринопитическая активность, полученной после элюирования фракции, на фиг.2 — пик активного энзима совпадает с маленьким протеиновым пиком °

Пример. При выполнении способа получения в качестве микроносителя используют Цитодекс-3 (Cytodex-3), 15 производимый фирмои "Pharmacia Fine

Chemicals", в концентрации 10 г/л.

Аппаратура для культуры представляет собой ферментер типа Biocul объемом

5 л, производимый фирмой "L.Н. Fer- 20

mentation Std", с рабочей емкостью, равной 4,5 л,соединенной с резервуаром для разбрызгивания, содержащим

2 и среды. Соотношение между площадью поверхности и средой было более чем в 4 раза выше, чем в бутылочках, установленных в роллере при использовании того же самого уровня концен;рации микроносителя, и клетки могли поддерживаться жизнеспособными и 30 активными только с помощью тщательноro контроля концентрации кислорода, величины водородного показателя,концентрации питательного вещества и высоких скоростей полива, Для куль— тивирования используют линии клеток

GPK (cucmi-222) или ВЕВ (cucmi-221), которые задепонированы в Институте

Пастера.

Поле для клеток, содержащее 2,5<10 клеток, получают в культуре, находя— щейся в роллерной бутылочке, и добавляют к культуре, содержащей agles (МЕМ) среду для роста с добавлением 45

1ОЕ фоетапьной бычьей сыворотки, 0,001Z Tween-80 и буферного раствоо

pa HEPFS. Через 72-96 ч при 37 С клетки вырастают в достаточном количестве и покрывают примерно 70Z от имевши. гося количества субстрата (как правило, примерно 1,4 10 клеток). Среду сливают, клетки и микроносители промывают два раза средой, не содержащей сыворотку и затеи за55 ливан т сверху не содержащей сыворотку средой для роста (МЕМ) . Далее о производят инкубацию при 37 С в течение по меньшей мере 60 ч с тем, чтобы обеспечить дальнейший рост клеток и секрецию энзима.

В конце периода инкубации верхний слой сливают и подвергают вращению в течение 10 мин, в количестве 450 g c тем, чтобы удалить любые клетки,присутствующие в суспензии. Верхний слой затем подвергают вращению в течение

30 мин при 5 С, при 40000 g. Аликвотную долю объемом 50 мл отделяют для анализа фибрина на пластинке, и верхний слой подвергают сушке вымораживанием и переносят во взвешенную бутылочку и хранят в холодильнике с жидким азотом. Альтернативно верхний слой может быть подвергнут концентрированию путем ультрафипьтрации.

Концентрированный верхний слой к пьтуры псдвергают частичной очистке путем хроматографирования на колонке, заполненной агарозой хелата цинка (размером 4,4 12 см), предварительно уравновешенной при 4 С с помощью

0,02 M трис-НС1 рН 7,5, содержащего

1 М хпорида натрия и 0,017 Tween-80.

5 л среды,,подвергнутой кондиционированию, подают на эту колонку, скорость подачи составляет 120 мл/ч.

После промывания колонки 2 литрами уравновешивающего буферного раствора соединенные протеины подвергают эпюированию с линейным градиентам от 0 до 0,05 М имидазола (общий объем

1 и) в уравновешивающем буферном растворе. Элюант собирают в фракции объемом 8 мл. Ультрафиолетовое поглощение для каждой фракции определяют при длине волны, равной 280 нм, и фибриНолитическую активность определяют с помощью опыта на фибриновой пластинке. Активные фракции объединяют и их характерную активность определяют по методу времени лизиса фибринового тромба.

На следующей стадии слитые вместе фракции вводят в колонку размером

2,2 15 см, заполненную конканавалин-Л-агароэой, уравновешенную с помощью

0,01 М буферного раствора фосфата натрия (рН 7,5), содержащего 1 М хпорида натрия и 0„01Е Тыееп-80.Эту колонку промывают уравновешивающим буферным раствором со скоростью подачи, равной 10 мл/ч, до тех пор, пока ультрафиолетовое поглощение элюанта при длине волны, равной

280 нм, не стало ниже 0,15. Линейный градиент уравновешивающего буферного

1507204 раствора (200 мл) к О, О1 М буферному раствору фосфата натрия (рН 7,5), содержащему 0,6 M альфа-D-метилманнозида, 2M KSCN и 0,017 Tween-80,использовался для элюирования абсорбированного материала. Фракции объемом

5 мл собирают с целью измерения ультрафиолетового поглощения и фибринолитической активности, как видно на фиг.1. Активные фракции сливают вместе, и концентрацию KSCN увеличивают до 1,6 М путем добавления твердого KSCN. Полученный таким образом раствор далее подвергают концентрированию путем диалиэа с помощью твердого полиэтиленгликоля, имеющего мол.м. 15000-20000 дальтонов.

Концентрированный раствор (5-8 мл) подвергают центрифугированию и гельфильтрировапию на колонке размером

2,5i90 см, заполненный "Sephadex

С-150" (сверхмелкий) в буферном растворе 0 01 М сульфата натрия (рН 7 5), содержащем 1,6 М KSCH и 0,017

Tween-80. Фракции объемом 3 мл собирают при скорости подачи, равной

9 мл/ч. Активный энзим элюнровался в качестве единственного пика, который совпадает с маленьким протеиновым пиком (фиг.2). Фракции, содержащие активный энзим, сливают вместе, концентрируют путем диализа по отношению к полиэтиленгликолю и хранят о при -80 С. Альтернативно элюант,полу4енный из колонки, заполненной конканавалин-А-агарозой, может быть далее подвергнут очистке с помощью афинной хроматографии на лизин-сефарозе или фибрин-сефарозе.

Результаты, полученные при очистке энэима, произведенного из кератоцитов морских свинок, суммированы в табл.1.

Фибринолитическую активность экзимов, полученных из кератоцитов морских свинок и эпителия грудной железы человека, сравнивали с активностью раствора стандартной урокина" зы. Стандартная порция (бутылочка) урокинаэы подвергалась растворению в 50 мМ буферном растворе диэтилбарбитурата натрия, содержащем 0,1 М хлорида натрия и 0,25 вес.7/объем-. ным желатина (pH 7,8). Несколько растворов стандартной урокиназы и фибринолитического энзима были при5

55 готовлены в указанном буферном растворе. Все другие реагенты разбавлялись в том же самом буферном растворе и держались на холоде перед смешением 0,2 мл разбавленной урокиназы ипи растворов. энзима помещались в серию трубок, размером 10i50 мм.

Далее в трубки вводилось 0,05 мп человеческого плазминогена (3 мг/мл), 0,5 мл человеческого фибриногена (0,25 вес.X/oáúåìíûì) и 0,05 мл тромбина (40 NIH ед/мл). Содержимое трубок подвергалось быстрому перемешиванйю и затем трубки помещались в водяную баню, имеющую температуру о

37,5 С. Сразу же производилось включение секундомера, и время, соответствующее окончанию лизиса, фиксировалось при аккуратном переворачивапии трубкц. Калибровочный график был получен в логарифмических координатах как для времени лизиса, (в минутах), так и содержания урокиназы в тромбе. Фактор разбавления раствора энзима, дающего то же самое время лизиса, что и раствор стандартной урокиназы при 0,5 IU/ìë был принят для расчета активности неразбавленного раствора энзима. Фпбринолитическая активность энзима была таким образом варажена в международных единицах (international units).

Средняя характерная активность (фибринолитнческая активность/мг протеина) очищенного энзима, полученного нз кератоцитов морских свинок, была равна примерно 12500 IU/ìã.

Контроль. Одна порция объемом

670 мг материала, высушенного вымораживанием, была получена в соответствии с предложенной методикой, но без присутствия в нем клеток. Этот материал двл отрицательные результаты при проведении анализа пластинки фнбрина. Верхние слои нз нескольких других линий клеток также проанализированы на фибринолитическую активность и также дали либо отрицательный результат, либо показали только следы фибринолитической активности.

Полученные результаты представлены в табл.2.

Молекулярная масса очищенного энзима, полученного из кератоцитов морских свинок, была равна примерно

5600042000 в невосстанавливающих условиях, и примерно, 62000+3000 в вос» станавливающих условиях (путем добав

1507204 в основном одинаковыми по составу, но с небольшими различиями, которые можно было ожидать, поскольку это дна различных вида животных (человек и морская свинка). Как .кератоци fb1 морских свинок, так и эпитслий человеческой грудной железы имеют аминокислотный состав, отличающийся от аминокислотного состава, опубликованного дпя 11ЕРА.

25

Способность энзпма,произведенного из кератоцита морских свинок, присоединлться к полному кровяному тром- 30 бу была экспериментально исследована

"в пробирке" с помощью замкнутой циркупяционной системы типа С1>апс11ег, Экспериментальный сшитый тромб был произведеn в пОлиэтиленовой тРУбке 35 с внутренним диаметром 3 мм (которую предварительно промывали 0,01 ным раствором Tween) путем смешения цитрированной цельной человеческой крови (1 мл) с 50 мл 0,02 M СаС1> и 40

25 мл тромбина (1001<1П1 Ч/мл). После

<> инкубирования в гечение 1 ч прп 37 С при вращении со скоростью 30 об/мпн тромб выливался н чашку Петри,дважды промывался буферным раствором 45

0,05 M диэтипбарбитурата натрия (рН

7,8), содержащим 0,25 вес. /объемным желатина и 0,01М хлорида натрия, Этот тромб затем аспиратором переносился обратно в трубку вместе с 0,9 мл аутогенной плазмы или буферного раствора. Затем добавляли 100 t!JI энзима, произведенного пз кератоцитов морских свинок (прпмсрно 500 международных единиц). Циркуплционная система снова устанавливалась на вращающийся стол н подвергалась инкубации

2 ч при 37 С. 11опученные тромбы затем из <по к а. III, пр омь<з<али буферным пения 2 — мс ркаптоэтанола), ч ro позволяет спелать вывод о присутствии ди< сульфидных мостиков в молекуле энзима. Молекулярная масса хорошо сог5 ласуется с приблизительным молекулярной массой, равным 65000+3000, как было оценено с помощью гельфильтрации на колонке, заполненной Sephadex G-150.Изоэлектрические точки (pI) очищенных знзимов, полученных из кератоцитов морских свинок и эпителя человеческой грудной железы, равны 4,6 ед.

Иэ табл.3 следует, что энзимы 15 кератоцитов морских свинок и эпителя человеческой грудной железы являются раствором, как было указано выше, и затем экстрагировали с помощью 1 мл буферного раствора 0,05 М диэтилбарбитурата натрия, характеризуемого величиной водородного показателя, равной 7,8 ед РН и содержащего 1М о

KSCN в течение 1 ч при 4 С. Аликвотные доли экстракта и верхнего слоя тромба, объемом 50 мл, иэ трубки далее наносились на пластинки фибрина, содержащие плазминоген, и подвергались инкубированию в течение 18 ч при 37 С.

Полученные результаты показывают, что фибринолитическая активность экстракта тромбов, а следовательно, и количество соединенного энзима были значительно выше, чем в верхнем спос. тромбов. Аналогичные результаты были получены при экспсриментах, которые повторены с использованием энзима, меченого изотопом In.

С точки зрения этих результатов энзим, меченый радиоактивным изотопом, может быть использован в диагностических целях как эффективное средство локализации тромба в организм< . !

Таким образом, использование стабильной линИи неканперогенных клеток для получения знзима, характеризующегося фибринолигической активностью самого по себе или как плазмогенный активатор позволяет получить вещество с бопсе высокой фармакологической чистотой. Известные .способы получения подобных энзимов с аналогичной активностью либо используют канцерогенные клетки, либо нестабильные линии клеток. Использованис линии канцерогенных клеток неприемлемо ввиду опасности использования вредного материала. Нестабильные линии клеток нельзя использовать в промышленном способе II.!-за их ограниченного времени жизни.

Формула из < бр етения

Способ получения вещества, обладающего фибринолитпческой активностью и/или активностью активатора плазминогсна путем культнвирсвания зависящей от сыворотки крови культуры клеток, отбора ку:п,туральной среды, ее центрифугированпл с последующим хроматографическим «тл..<еннем и

1507204

Та блиц а 1

Объем, мл 1 Общий Общая ! протеин, активмг ность, IU

Выход, %

Специфическая акФактор очистки

Носитель тивность, IU/ìã

Кондиционированная среда

Хелат-цинкаагароза

Конканавалин-А-агароза

Сефадекс С-150

5, ООО

1, 606 57, 800 36

205 54,100 264

100

93

7,3

72

11

38,100

25,000

3,464

12,500 бб

96

347

Таблица 2

Фибринолиз линиямп клеток

Клетки происхождение обозначение верхний слой

GPK

787Т69

643 101

376т43

ВЕВ

Не определялось

НеЬа

34 8

ФЖС5

30+8, очисткой целевого продукта, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения фармакологической чистоты целевого продукта, для культивирования используют линию клеток GPK (cucmi-222) или ВЕВ (cucmi-221), при этом культивацию проводят в среде

Minimum Essential Medium Eagle, содержащей 107 фоетальной бычьей сыворотки, 0,0017 Tween-80 и 20 мИ буферного раствора HEPES, до концентрации клеток 1,4 x10 " клеток, затем среду отделяют, клетки заливают средой, не содержащей сыворотку, и повторно культивируют, отобранную среду освобождают от клеток и центрифугируют в течение 30 мин при 40000 g супернатант концентрируют, пропускают через колонку, заполненную агарозой хелата цинка и предварительно уравновешенную 0,02 M раствором трис-соляной кислоты рН 7,5, содержащем 1 M хлорида натрия и 0,017

Tween-80, затем элюируют белки лиКератоциты морских свив нок

Молочная железа человека

Человеческая шейная карцинома

Человеческие фибробласты легких нейным градиентом от О до 0,05 М имидазолом, отбирают активйые фрак-, ции, вводят их в колонку, заполненную конканавалин-А-агарозой и уравновешенную 0,01 М раствором фосфата натрия рН 7,5, содержащем 1 М хлорида натрия и 0,017 Tween-80, вновь проводят элюцию линейным градиентом

0,01 M раствором фосфата натрия,содержащем 0,6 M альфа-D-метилманнозида, 2 М роданида калия, 0,017

Tween-80, вновь собирают активные фракции, к ним добавляют роданид калия до концентрации 1,6 М,. полученный раствор диализируют срез твердый полиэтиленгликоль, затем центрифугируют, супернатант пропускают через колонку, заполнеснную сефадексом

2p G-150 в буферном растворе 0,01 И сульфата натрия рН 7,5, содержащем

1,6 М роданида калия и 0,017

Tween-80, затем целевой продукт злюируют и концентрируют дпалпзом на

25 полнэтиленгликоле.

Фибринолитический индекс, выраженный в единицах плаэмина

1507204

Продолжение табл.2

Клетки

Фибринолитический индекс, выраженный в единицах плазмина

1 верхний слой обозначение экстракт клетки

Sw188

Мышиные эндотелиальные клетки

Печени крысы паренцимальные клетки

Паренцимальные клетки печени Шимпанзе

Эпиталии почек зеленых обезьян

Вирусные трансформированные ЗТЗ-клетки

ЗТЗ

153+21

96 13

17+4

R1C W

56+13

FCC

GL× 3

Не определялось

SV 40 ЗТЗ

39+17

Таблица 3

Составы аминокислот (выраженные как количество, оставшееся в процентах) Кератоциты Эпителий морских молочной свинок GPK железы ВЕВ

Аминокислота Активатор плазминогена злокачественной меланомы

Цнстеиновая кислота

Asp

Thr

Ser

GLU

PrO

GLy

AIa

Ча?

MeI

П.eU

LeU

Tyr

Phe

HIS

IyS

Arg

Не определялось

9,8

5,4

9,2

13,1

7,1

10,4 б,б

4,1

0,9

3,0

8,1

4,0

3,7

3,3

5,5

5,9

10,9

5,1

6,4

10,1

6,1

8,4

7,8

6,0

2,4

4,8

9,7

3 5

4,5

2,8

6,5

4,8

2,1

9,8

4,6

6,4

11,5

4,3

7,1

8,3

6,7

1,0

3,5

13,9

2,2

3,6

2,6

7,1

5,1

1507204

1Д7

Составитель Л. Шилина

Техред М.Ходанич Корректор И. Муска

Редактор Н. Рогулич

Заказ 5452/59 Тирах 643 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ухгород, ул, Проектная, 4

ФагГ ц 1