Способ очистки протеиназ цистеинового типа

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способам очистки протеолитических ферментов цистеинового типа из растений. С целью упрощения процесса в способе очистки протеиназ цистеинового типа аффинной хроматографией предложено в качестве сорбента использовать сефарозу, модифицированную иминодиуксусной кислотой, содержащую координационно связанные ионы ртути, а элюцию вести буферным раствором, содержащим 0,4-0,6 М NaCl, при рН 6,5-7,5. Принципиальным отличием предлагаемого сорбента является то, что, сорбирование происходит за счет ионов ртути, координационно связанных с поверхностью сорбента, а не ковалентно связанных с ним, что позволяет осуществлять злюцию сорбированного белка в более мягких условиях солевым раствором фосфатного буфера, а не дорогостоящими М вредными реактивами , такими как вб -цистеин и Jb -меркаптоэтанол. Кроме того, способ очистки ферментов на предлагаемом сорбенте дает возможность значительно упростить стадию сорбции протеиназ т.к. отсутствует необходимость обрабатывать ферменты активирующими добавками и освобождаться от них перед очисткой, а также увеличить производительность за счет высокой емкости сорбента. (Л оа sj ю со to

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИН (5р 4 С 12 Н 9/00 9/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ 0ВИДЕТЕЛЬСТВУ (ц

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4105833/31-13 (22) 20.06.86 (46) 29.02 ° 88. Бюл. У 8 (71) Институт биохимии им.А.Н.Баха (72) E.Â.Èåâëåâà, А.В.Зимачева и В.В.Мосолов (53) 663. 15(088.8) (56) БН8йеппап I.À.À., Wijdenes Q.

An agarosa mercurial column for the

separation of mercaptopapain and

nonmercaptopapain.-Biochim. Biophys, Acla, 1970, 200, 593-595.

Мосолов В.В., Костанова Е.А., Валуева Ж.А. Взаимодействие цистеиновых протеиназ с соевым ингибитором трипсина (ингибитор Кунитца). — Прикладная биохимия и микробиология, 1985, XXI ° вып. 2, с. 167-172. (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОТЕИНАЗ UHCТЕИНОВОГО ТИПА (51) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам очистки протеолитических ферментов цистеинового типа из растений. С целью упрощения процесса в способе очистки протеиназ цистеинового типа аффинной хроматографией предложено в ка„SU„„1377292 А 1 честве сорбента использовать сефарозу, модифицированную иминодиуксусной кислотой, содержащую координационно связанные ионы ртути, а элюцию вести буферным раствором, содержащим 0,4-0,6 М NaCi, при рН 6,5-7,5.

Принципиальным отличием предлагаемого сорбента является то, что, сорбирование происходит sa счет ионов ртути, координационно связанных с поверхностью сорбента, а не ковалентно связанных с ним, что .позволяет осуществлять элюцию сорбированного белка в более мягких условиях солевым раствором фосфатного буфера, а не дорогостоящими м вредными реактивами, такими как oL --цистеин и f3 -мер- Ю каптоэтанол. Кроме того, способ очистки ферментов на предлагаемом сорбенте дает возможность эначитель- С но упростить стадию сорбции протеиназ я т.к. отсутствует необходимость обрабатывать ферменты активирующими добавками и освобождаться от них перед > очисткой, а также увеличить произво- фф дительность за счет высокой емкости «) сорбента. «3

1377292

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам очистки протеолитических ферментов цистеинового типа из растений.

Цель изобретения — упрощение процесса.

Изобретение заключается в том, что в способе очистки протеиназ цистеинового типа аффинной хроматографией предложено в качестве сорбента использовать сефарозу, модифицированную иминодиуксусной кислотой, содержащую координационно связанные ионы ртути, а элюцию вести фосфатным буфером, содержащим 0,4-0,6 М NaC1 при рН 6,5-7,5.

Принципиальным отличием предлагаемого сорбента является то, что сорбирование происходит за счет ионов 20 ртути, координационно связанных с поверхностью сорбента, а не ковалентно связанных с ним. Это позволяет осуществлять элюцию сорбированного белка в более мягких условиях.

Способ осуществляют следующим образом.

Очистке подвергают, препараты ферментов, полученные из латекса дынного дерева Carica papaya или растений рода Ficus. Сорбент получают коналентным присоединением к эпоксипроизводному сефарозы иминодиуксусной о кислоты при 65 С в течение 24 ч. Насыщение поверхности полученного сор- 35 бента осуществляют пропусканием через колонку с сорбентом 1Х-ного раствора HgC1 . Несорбированные ионы ртути отмывают водой. На колонку наносят раствор белка в 0,1 М фосфатном 40 буФере, рН 6,5-7;5, Элюцию ведут тем же буфером, содержащим 0,4-0,6 М

NaC1. При значениях рН меньших, чем

6,5, не происходит полная сорбция белка, а при значениях выше 7,5 наб- 45 людается неспецифическая сорбция белков. Использование меньших, чем

0,4 М концентраций NaC1 приводит к неполной элюции ферментов, а при концентрациях больших 0,6 М элюируются 50 неспецифически сорбированные белки.

Достигаемая степень очистки равна 2.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 140 мг латекса из дынного дерева Carica papaya (отечественный препарат производства Гагрского опорного пункта Главного Ботанического сада AH CCCP) с активностью

19 ед/мг белка растворяли в 40 мл

0,1 M фосфатного буфера, рН 6,5 и пропускали через колонку с 6 мл сефарозы, модифицированной иминодиуксусной кислотой, содержащей координационно связанные ионы ртути. После отмывания колонки тем же буфером от несорбированного белка проводили элюцию 0,1 M фосфатным буфером, рН

6,5, содержащим 0,4 М NaCl. Получен-! ный раствор содержал 36 мг белка с протеолитической активностью 38 ед/мг белка.

Пример 2. 140 мг латекса растворяли в 40 мп 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,5 и пропускали через колонку с 6 мл сорбента. После отмывания колонки тем же буфером от несорбированного белка проводили элюцию О, 1 M фосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 0,6 М NaCl. Полученныйраствор содержал t20 мг белка с протеолитической активностью 30 ед/мг белка.

Пример 3. Через колонку с

6 мл сорбента пропускали раствор

140 мг.латекса в 40 мл 0,1 M фосфатного буфера, рН 7,0. После отмывания колонки от несорбированного белка осуществляли элюцию сорбированного белка с помощью 0,5 М NaC1 в О, 1 М фосфатном буфере, рН 7,0. Получили

107 мг белкового материала с протеолитической активностью 38 ед/мг °

Пример 4. 50 мг фицина (препарат латекса растений рода Ficus, Calb iochem) растворяли в 30 мл 0,1 М фосфатного буфера и пропускали через колонку с сорбентом. После промывания колонки белковый материал элюировали 0 5 M NaC1 в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0. Получили 7 мг фицина,. активность которого соответствует

40 ед/мг, что в 2 раза превышает активность исходного препарата.

Как видно из представленных примеров, оптимальными условиями для элюции цистеиноных протеиназ с поверхности сорбента являются О,1 М фосфатный буфер, рН 7,0, содержащий

0,5 M NaC1. В результате полученные препараты ферментов латекса и фицин имеют активность 38 и 40 ед/мг соответственно. Таким образом, применение более простого сорбента, содержащего на своей поверхности координационно связанные ионы ртути, позволяет применять для элюции сорби1377292 производительность за счет высокой емкости сорбента.

Составитель В.Соина

Редактор Н.Киштулинец Техред М.Дидык

Корректор М.Максимишинец

Подписное

Заказ 816/18 Тираж 52()

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 рованных протеиназ простой способ, заключающийся в промывании сорбента фосфатным буфером, содержащим NaCl.

Способ очистки ферментов на предлагаемом сорбенте дает возможность значительно упростить стадию сорбции протеиназ, так как отсутствует необходимость обрабатывать ферменты активирующими добавками и освобождаться от них перед очисткой, позволяет осуществлять элюцию более простым способом, т.е. солевым раст- вором фосфатного буфера, который исключает применение более дорогостоящих (к-цистеин и P-ìåðêàïòîýòàíîë) и вредных (P-меркаптоэтанол) реактивов более дешевым и безвредным (хлористый натрий), а также увеличить

Формула из обре те ния

Способ очистки протеиназ цистеинового типа, предусматривающий аффинную хроматографию на сорбенте на основе сефароэы, содержащем ионы Й8", с последующей элюцией, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве сорбента используют сефарозу, модифицированную иминодиуксусной кислотой, содержащую координационно связанные ионы Hg +, элюцию ведут фосфатным буфером, содержащим 0,4-0,6 M NaC1, а рН буферного раствора устанавливают 6,5-7,5.