Способ оценки клеточных иммунных реакций in vitro

 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам оценки функций эффекторов клеточного иммунитета , и может быть использовано в исследованиях патогенеза, механизмов иммунокоррекции и диагностике иммунопатологических процессов, Цель изобретения - повышение точности оценки, а также упрощение способа за счет оценки миграционной и адгезивной способности клеток с использованием U-образной формы лунки планшета и двух доз митогена или антигена. Для этого лейкоциты инкубируют в лунках планшета для иммунологических реакций (U-образной формы) со стимулирующей и ингибирующей дозами митогена или антигена в течение 18 ч и после определения количества прилипших клеток оценивают по их соотношению при стимулирующей и ингибирующей дозах митогена или антигена активность функции эффекторов клеточного иммунитета. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам оценки суммарной (поликлональной) и специфической (в отношении определенного антигена) активностей эффектоpов иммунной системы. Результаты оценки могут быть использованы в исследовании патогенеза, определении показаний и контроля эффективности иммуннокоррекции, а также в диагностике заболеваний, связанных с нарушениями функций эффектов клеточного иммунитета при иммунодефицитах, аутоиммунитете и аллергии. Цель изобретения - повышение точности при одновременном упрощении способа. Способ выполняется следующим образом: гепаринизированную кровь смешивают с 10% -ным раствором желатина в отношении 9:1, инкубируют 45 мин при 37^оС. Отбирают 2 мл полученной лейковзвеси, дважды отмывают средой 199 (5 мл, 7 мин, 200g), осадок суспендируют в 1 мл среды. Доводят концентрацию клеток в среде 199 с 10% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота до 2 х 10⁶ кл/мл. По 50 мкл лейковзвеси разносят в 6 лунок планшета для иммунологических реакций (U-образные лунки, Ленинградский завод медицинских полимеров). В лунки N. 1 и 2 добавляют по 50 мкл среды 199 (контроль) в лунки N 3 и 4 50 мкл среды 199 с фитогемагглютинином (ФГА-Р, "Дифко", США) в разведении 1: 2500 (стимулирующая доза), в лунки N 5 и 6 50 мкл с ФГА в разведении 1:500 (ингибирующая доза). Планшет инкубируют при 37^оС во влажном воздухе с 5% СО₂ в течение 18 ± 1 ч, затем 10 мин при комнатной температуре в наклонном (60-80^о) положении, после чего неприлипшие клетки удаляют пипеткой после однократного суспендирования, лунки промывают 100 мкл среды комнатной температуры, планшет возвращают в горизонтальное положение и в лунки помещают по 100 мкл раствора Версена. Планшет инкубируют 30 мин при 37^оС, 15 мин при комнатной температуре, клетки ресуспендируют и в лунки добавляют по 50 мкл 10%-ной уксусной кислоты, после чего подсчитывают количество клеток в камере Горяева. Показатель эффекторных функций (ПЭФ) высчитывают по формуле ПЭФ = где А - отношение количества клеток в лунках со стимулирующей дозой ФГА к таковому в контроле; Б - отношение количества клеток в лунках с ингибирующей дозой ФГА к таковому: в контроле. ПЭФ с ФГА позволяет оценить суммарную (поликлональную) активность эффекторов клеточного иммунитета. У здоровых людей ПЭФ с ФГА составляет ряд значений от 2,5 до 18,6 (в среднем 7,62). Специфическая (в отношении определенного антигена) активность эффекторов клеточного иммунитета оценивается таким же образом, как и с ФГА, только к лейковзвеси добавляют антиген в стимулирующей и ингибирующей дозе, ПЭФ с антигеном высчитывают по той же формуле. Для осуществления способа с митогенами и антигенами необходимо заранее определить стимулирующую и ингибирующую дозы данного митогена или антигена. Для этого определяют оптимальную ингибирующую миграции дозу и готовят серию 4-5-кратных разведений данного митогена или антигена с учетом этой дозы, которые тестируют на лейковзвеси 3-5 здоровых доноров (для митогена) или 3-5 сенсибилизированных больных (для антигена). Обычно достаточно исследовать однократно 5 разведений митогена (или антигена). П р и м е р 1. Оценка суммарной (поликлональной) активности эффекторов клеточного иммунитета. Для осуществления способа вначале определяют стимулирующую и ингибирующую дозы ФГА, используя периферическую кровь 5 здоровых доноров. Лейковзвесь (полученная как описано выше) разнесена в 12 лунок, в которые добавлена среда 199 и среда с пятью разведениями ФГА (все по 2 лунки). В табл. 1 представлены результаты подсчета прилипших клеток. Лейковзвесь больного остеомиелитом тестирована с ФГА в стимулирующий и ингибирующей дозах, ПЭФ = 1,04. Поскольку нижняя граница ПЭФ с ФГА в норме составляет 2,5, можно сделать заключение о том, что функция клеточного иммунитета снижена. П р и м е р 2. Оценка активности эффекторов клеточного иммунитета у больного ревматоидным артритом. Вначале также оценивают стимулирующую и ингибирующую дозы антигена (водносолевого экстракта фибробластов эмбриона человека - фибробластический антиген (ФАГ) на примере лейковзвеси из периферической крови трех больных ревматоидным артритом (см. табл. 2). Лейковзвесь больного ревматоидным артритом тестирована с ФАГ. ПЭФ = 6,52. Поскольку в норме ПЭФ с ФАГ не превышает 1,4, можно сделать заключение о повышенной активности эффекторов клеточного иммунитета в отношении фибробластического антигена у данного больного. Таким образом, за счет учета дополнительного фактора ингибиции миграции и прямого действия митогена или антигена на адгезивные и миграционные свойства нейтрофилов и моноцитов способ позволяет более точно оценивать клеточный иммунитет, а также упростить оценку за счет исключения процедуры фиксации и окрашивания перед подсчетом клеток и за счет исключения манипуляций с капиллярами, камерами и другими приспособлениями.

Формула изобретения

СПОСОБ ОЦЕНКИ КЛЕТОЧНЫХ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ IN VITRO путем инкубации лейкоцитов в планшете с митогеном или антигеном в ингибирующей прилипание дозе и последующего определения числа прилипших клеток, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения информативности способа за счет выявления миграционной способности клеток, используют планшеты с лунками полушаровидной формы, дополнительно проводят инкубацию с митогеном или антигеном в стимулирующей дозе, а оценку функциональных клеточных реакций осуществляют по соотношению количества прилипших клеток при стимулирующей и ингибирующей дозах.

РИСУНКИ

Рисунок 1