Способ получения эндонуклеазы-рестриктазы, расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 @ =g @ cgc=3 @

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Рестриктаза может быть использована для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии. Цель изобретения - повышение выхода и улучшение качества целевого продукта. Способ заключается в том, что в качестве продуцента рестриктазы используют штамм ВКПМ В-4275. Культивирование проводят в условиях аэрации при 37°С на питательной среде, содержащей, л:сердечно-мозговой экстракт 37,0

НАД 2,0

гемин 10,0, PH 7,0-7,2 до достижения оптической плотности суспензии клеток 2,2-2,5 о.е. Клетки разрушают ультразвуком, центрифугируют и проводят очистку фермента из полученного бесклеточного экстракта путем хроматографии на фосфоцеллюлозе, гепаринсефарозе и голубой сефарозе в калий-фосфатном буфере, PH 7,4-7,5. Элюцию фермента проводят градиентом NACL 0,1-0,8 М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и 0,0-1,0 М при хроматографии на гепаринсефарозе и голубой сефарозе. При использовании способа получают высокий выход высокоочищенной рестриктазы HIN61, расщепляющей последовательность нуклеодитов 5Ъ-G @ CGC-3Ъ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

5 А1 (19) (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П(НТ СССР

t (21) 4431491/30-13 (22) 24 ° 05,88 (46) 07.07.90. Бюл, ¹ 25 (71) Научно-производственное объединение "Фермент" и Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (72) Л.Г.Лазарявичюте, А.М.Падегимене, Э.-Л,Ю.Кюдулене> В.С.Лаучис, Ю,Б.Битинайте, И.М.Грубер, В М.Поляченко., И.Д,Горбачев, В.В,Буткус .и Э.-А.А.Янулайтис (53) 577.15(088.8) (56) S.Shen et al. Restriction endonuclease from three strains of Haemophilus, Scientica Sinica. 1980, 23, 11, р, 1435-1442. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЧ ЭНДОНУКЛЕАЗЫРЕСТРИКТАЗЫ> РАС!ЦЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5 СмССС (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, Рестриктаза может быть использована для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии. Цель изобретения—

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения рестриктаз и может быть использовано для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии.

Целью изобретения является повы- шение выхода и качества целевого фермента.

Способ заключается в культивировании штамма — продуцента Haemophi(51)5 С 12 N 9/22//(С 12 N 9/22, С 12 R i 21) 2 повышение выхода и улучшенияе качества целевого продукта ° Способ заключается в том, что в качестве продуцента рестриктазы используют штамм ВКПМ

В-4275. Культивирование проводят в условиях аэрации при 37 С на питательной среде, содержащей, л : сердечно-моз говой экстракт 37,0; НАД 2,0; гемин

10,0, рН 7,0-7,2 до достижения оптической плотности суспензии клеток

2,2-2,5 о.е, Клетки разрушают ультразвуком, центрифугируют и проводят очистку фермента из полученного бесклеточного экстракта путем хроматографии на фосфоцеллюлозе, гепаринсефарозе и голубой сефарозе в калийфосфатном буфере, рН 7,4-7,5. Элюцию фермента проводят градиентом NaC1

0,1-0,8 M при хроматографии на фосфоцеллюлозе и 0,0-1,0 М при хроматографии на гепаринсефарозе и голубой сефарозе. При использовании способа получают высокий выход высокоочищенной рестриктазы Hin 61, расщепляющей последовательность нуклеотидов

5 -С СГС-3 .

lus influenzae (RFL6) ВКПМ B-4275 на питательной среде, содержащей, г/л: экстракт мозга и сердца теленка 37,0; никотинамидадениндинуклеотид (НАД)

2,0> гемин 10,0;рН 7,0-7.,2, разрушение клеток при помощи ультразвука, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гепаринсефарозе и голубой сефарозе в

10 мМ калийфосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 10 мИ 2-меркантоэтанола, О, 1 мИ ЭДТА с элюцией фермента гра1576565 диентом НаС1 при изменении концент-.— рации от 0,.1 до 0,8М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и градиентом

0,0-1,0М при хроматографии на гепаринсефароэе и голубой сефарозе.

Используемый штамм Haemophilus in

fluenzae RFL 6 обладает следующими морфологическими, физиологическими и культуральными признаками.

Коккобациллярные клетки. Граммотрицательные, неподвижные, бескапсульные требует для роста Х и Y факторов на плотных средах формируют прозрачные мелкие колонии; гемолиэ 1, отсутствует ° Штамм образует уреазу, расщепляет ксилозу, образует индол, не имеет р-галактоэидазы и не утилизирует орнитин, На агаризованном экстракте мозга

20 и сердца теленка после 24 ч инкубации в термостате при 37 С образует мелкие, круглые, с ровными краями колонии. Колонии гладкие, блестящие, с агаром не срастаются В мясо-ментонном25 бульоне культура не размножается. Оптимальная температура роста 37 С.

Затем проводят очистку рестриктазы Hin-6 I путем хроматографии на фосфоцеллюлозе, гепаринсефарозе и голубой сефарозе в 10 мМ калийфосфатном буфере, РН 7,4, содержащем 0,1 мМ

ЭДТА и 10 мМ 2-меркаптоэтанола, с элюцией фермента градиентом NaC1

О, 1-0,8М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и 0,0-1,ОМ NaC1 при хромато-35 графии на гепаринсефарозе и голубой сефароэе. Апробированы четыре способа получения рестриктазы: фосфоцеллюлоза, гепаринсефароза„ фосфоцеллюлоза, голубая сефароза; фосфоцеллюло- 40 за, гепаринсефароза, ДЭАЭ-целлюлоза; фосфоцеллюлоза, гепаринсефароза, голубая сефароза. Только в последнем случае при использовании голубой сефароэы на третьей стадии очистки до- 45 стигается наиболее эффективная очистка рестриктазы, а полученный ферментный препарат по качеству и стабильности удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к ферментам как анали- 50 тическим реагентам.

Пример 1. Последовательность операций: культивирование штамма и получение биомассы, выделение и очистка рестриктазы:разрушение клеток, 55 хромотография на фосфоцеллюлозе, хромотография на гепаринсефарозе и хроматография на голубой сефарозе.

Для размножения и культивирования штамма используют сердечно-мозговой экстракт (Brain Heart Infusion "Difco") с добавлением Х и Y факторов.

Питательная среда в своем составе содержит 3,7Х экстракта мозга и сердца теленка, 0,027 никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и О, 1Х гемина, рН

7,0. Сердечно-мозговай экстракт стерилиэуют при 1 атм в течение 20 мин о

Э раствор гемина - при 70 С в течение

1 ч, раствор НАД - стерилизуемой фильтрацией.

Штамм Н, influenzae RFL поддерживают в лиофильно высушенном виде при

4 С. Криозащитную среду для хранения культуры готовят отдельно следующим образом: раствор сахарозы и желатины стерилизуют при 0,9 атм в течение

30 мин два раза через сутки и перед приготовлением бактериальной суспенэии в приготовленный стерильный раствор в асептических условиях добавляют такое же количество бычьей сыворотки.

Для оживления культуры в две пробирки с питательной средой (сердечномоэговой экстракт, НАД и гемин) и две пробирки с мясо-пептонным бульоном (для контроля чистоты культуры) переносят лиофильно высушенную культуру.

Пробирки инкубируют 18 ч при 37 С;

Затем бактериологической петлей культуру повторно пересевают в две пробирки с питательной средой и мясопептонным бульоном и помещают на круговые качалки при 80-100 об/мин. Через 18-20 ч культивирования проводят третий пассаж — для непосредственно- го засева ферментера: по О, 25- О, 30 мл таким образом полученной суспензии клеток добавляют в две колбы с

0,25 мл каждой среды. Инокулят выращивают на термостатированных круговых качалках при 200 об/мин, 37 С в течение 18-20 ч. Оптическая плотность суспензии инокулята при длине .волны

540 нм составляет 2,5-3,0 оптических единиц. Так полученный,инокулят засевают в лабораторный ферментер Виолафит", содержащий 10 л питательной среды. Культуру Н, influenzae RFL 6 выращивают при 37 С, РН 7,0-7,2 со скоростью перемешивания в первый час культивирования 150 об/мин и далее до 250 об/мин, а также подачей стерильного воздуха 3 л/мин в первый. час роста культуры, с постепенным увеличением до 5 л/мин на 6-м часу

1576565

25 роста. Заданный рН во время выращивания культуры поддерживают добавлением насыщенного раствора бикарбоната натрия..

Во время культивирования периоди5 чески отбирают пробы и измеряют оптическую плотность суспензии клеток, Культивирование штамма проводят до поздней логарифмической фазы ростаоптическая плотность суспензии клеток составляет 2,2-2,5 о.е. (длина волны 540 нм) .

Культуральную жидкость охлаждают до 4"С и центрифугируют на проточной центрифуге типа ЦЕПА при 2,5 10 об/мин

Полученную биомассу хранят при -20 С.

Выход сырой биомассы 2 5-3,0 г/л культуральной жидкости.

При разрушении и хроматографии 20 используют буферный раствор (Б):

10 мИ калийфосфатный буфер, рН

7,4, содержащий 0,1 мИ ЭДТА и 10 мИ

2-меркаптоэтанола.

Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК фага лямбда с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле. Реакционная смесь для гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазой

Hin61 содержит 10 трис-НС1, рН

8,5, 50 мИ NaC1,3 мИ MgC1<, 100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага лямбда в 40 мкл смеси и 5 мкл фермента. Реакцию проводят при 37 С

10 мин. Электрофореэ проводят в 0,1 M натрийборатном буфере, рН 8,2 с 2 мИ

ЭДТА в течение 2 ч при напряжении

100 В и силе тока 100 мА. Окрашенные этидийбромидом (! мкг/мл) гели про40 сматривают в УФ-свете.

За условную единицу активности принимается то количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч 45 полностью расщепляет.. 1 мкг ДНК фага лямбда.

Все операции по выделенно и очист.о ке Лермента проводят при 4 С.

Раз рушен ие клеток.

20 г биомассы:, полученной. при культивировании Н. influenzae RFL 6, сус-. пендируют в 60 мл буфера Б, содержащего О, 1 M NaC1, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2Т в

55 течение 10 мин н центрифугируют при

20000 об/мин на центрифуге Бекман Ж21Ц, ротор ЖА-20.

ХромотограЛия на Лосфоцеллюлоэе

Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 30 мл/и наносят на колонку 2,5 10 см с фосфоцеллюлозой, уравновешенной буфером Б, содержащим

О, 1 YNaC1. Колонку промывают 120 мл того же буЛера и элюируют линейным градиентом NaC1 от 0,1 до 0,8 И в

500 мл буЛере Б.Фракции, элюируемые при 0,52-0,62Л NaC1, содержат основную часть активности. Их объединяют и диализуют в течение 16 ч против

2,5 л буфера Б.

ХроматограЛия на гепаринсефароэе.

После диализа раствор фермента центрифугируют при 20000 об/мин на центриЛуге Бекман Fi-21Ц, ротор RA20.

Полученный супернатант со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,5 ° 10 см с гепарннсефарозой, уравновешенной буЛером Б, промывают этим же буЛером (40 мл) и элюируют линейным градиентом концентрации

NaC1 от О,О-до 1,0 И в !80 мл буфера

Б. Фракции, элюируемые при 0,74-0,86 М

МаС1, содержат основную часть .рестркктазной активности. Их объединяют и диализуют в течение t6 ч против

1 л буфера Б.

ХроматограЛия на голубой сефарозе.

Ферментный раствор после диализа со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,5 8 см с голубой сефарозой, уравновешенной буфером Б, промывают 40 мл того же буЛера и элюируют линейным градиентом концентрации NaCl от 0,0 до 1,0 И в 160 мл буЛера Б. Фракции, элюируемые при 0,50,6 И NaC1, объединяют и ферментный препарат концентрируют путем диализа против буЛера Б, содержащего 0,1 И

NaC1 и 507. глицерина (по объему). о

Ферментный препарат хранят при -20 С.

Из биомассы получают 15000 ед. активности рестрнктазы Н1пб! .

Формула изобретен ия

Способ получения эндонуклеазы-рестриктазы, расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 -G СГС-3 предус1 Ф ь|атривающий культивирование продуцента, разрушение клеток, с последующей по стадийн ой хромато графиче ской очисткой, отличающийся тем, .что с целью повышения выхода и качества целевого фермента, в качестве микроорганизма " продуцента используют

1576565

Составитель В.Варламов

Техред Л.Сердюкова

Корректор А.Обручар

Редактор Н.Рогулич

Заказ 1830 Тирак 489 Подписное

ВНЯИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.укгород, ул. Гагарина, 101 штамм Haemophiius influegzae ВКПИ В4275, первую стадию хроматографической очистки проводят на фосфоцеллюлоэе 111 в калийфосфатном буфере, рН 7,4-7,5, с элоцией фермента .градиентом NaC1 0,1-0,8 и, вторую осуществляют на гепаринсефарозе в том же буфере с элюцией фермента градиентом

NaCl 0,0-1,0 М, а окончательную очист-)

5 ку проводят в том же 6yhepe на голу- бой сефарозе с элюцией фермента градиен том NaC1, О, 0-1, 0 М.