Способ получения @ -карболиновых алкалоидов из гармалы обыкновенной

 

Изобретение относится к биотехнологии и к генной инженерии. Целью изобретения является повышение эффективности способа за счет получения постоянно растущей культуры PEGANUM HARMALA, сохраняющей способность к синтезу алкалоидов на уровне целого растения. Цель достигается за счет индукции ризогенеза в клетках гармалы путем инфицирования сегментов гипокотиля стерильных проростков вирулентным штаммом AGROBACTERIUM RHIZOGENES (штамм А-4), несущая Р-1 - плазмиду, что позволяет получить трансформацию, приводящую к образованию непрерывно растущей ризогенной культуры с высоким уровнем биосинтеза β-карболиновых алкалоидов.

сОюз сОВетсних сОциАлистичесних

РЕСПУБЛИН

А1 (19) (И) (51) 5

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К Д ВТОРИЧНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ пО изОБРетениям и ОтнРытиям

ПРИ ННТ СССР

t (21) 4443949/31-13 (22) 20.06.88 (46) 23.09.90, Бюл. 1(- 35 (71) Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева (22) И.Н.Кузовкина, И.Е.Альтерман, А.Гохар и А.Ф.Муратова (53) 575.224.2 (088,8) (56) DNA clonig, IRL Rress Oxford

Washington DC. 1985 . Chapter 4. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Р-КАРБОЛИНОВЫХ

АЛКАЛОИДОВ ИЗ ГАРМАЛЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (57) Изобретение относится к биотехнологии и к генной инженерии. Целью изобретения является повышение эффекИзобретение относится к области биотехнологии и .генной инженерии.

Целью изобретения является повышение эффективности способа за счет получения постоянно растущей культуры

Peganum harmala, сохраняющей способность к синтезу алкалоидов на уровне целого растения.

Способ состоит в том, что осуществляют направленное инфицирование г: .гипокотилей стерильных проростков гармалы с помощью вирулентного штамма Agrobacterium rhizogenes (штамм

А-4), несущего RI-плазмиду, которая, встраиваясь в геном клеток гармалы, вызывает их трансформацию, морфологическое проявление которой заключается в опухолевом росте корней.

Пример. Для проведения работы используют одномесячные стерильные проростки гармалы обыкновенной.

Инфицирование сегментов гипокотиля проростков проводят свежей культу2 тивности способа за счет получения постоянно растущей культуры Peganum

harmala, сохраняющей способность к синтезу алкалоидов на уровне целого растения. Цель достигается за счет индукции ризогенеза в клетках гармалы путем инфицирования сегментов гипокотиля стерильных проростков вирулентным штаммом Agrobacterium rhizogenes (штамм А-4), несущим RI-плазмиду, что позволяет получить трансформацию, приводящую к образованию непрерывно . растущей ризогенной культуры с высоким уровнем биосинтеза д-карболиновых алкалоидов. рой А.rhizogenes (18-часовой) в среде Мурасиге и Скуга в течение 24 ч при встряхивании на качалке . После инкубации обработанные сегменты промывают стерильной средой, подсушивают фильтровальной бумагой и помещают на агаризованную питательную среду MS, не содержащую гормонов с добавлением антибиотика (клафоран — 500 мг/л) для элиминирования бактерии. Через

3-4 недели на сегментах появляются участки с растущими корнями. Эти трансформированные участки отделяют и пересаживают на свежую среду того же состава. Через 2-3 пассажа (т.е.

6-9 недель) участки переносят на агаризованную питательную среду М$„ не содержащую антибиотик, и выращивают на ней в течение 3 недель. Иск- лючение антибиотика после элиминирования бактерии приводит к стимуляции роста корней и образованию значитель ной растительной массы (ростовой ин1594180 других регионов, приводит к аналогичным результатам и также позволяет получить непрерывно растущую культу-1 ру гармалы обыкновенной.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить эффективность получения р-карболиновых алкалоидов из гармалы обыкновенной за счет получения пос гоянно растущей культуры, сохраняющей высокий уровень биосинтеза — карболиновых алкалоидов..

Ф о р и ул а и з о б р е т е н и я

Составитель Т.Забойкина

Техред М.Ходанич Корректор O.ципле

Редактор Н.Рогулич

Заказ 2812 Тираж 298 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 декс полученной риэогенной культуры

6-ro пассажа составляет от 15 до

20 в течение 3-недельного ее роста).

Хроматографирование метанольного экстракта, полученного из лиофилизи5 рованной культуры, на тонком слое

Si0y в системе хлороформ: метанол: аммиак (10:4:1) с последующим элюированием гармина и гармалола покаэыва- 1п ет, что концентрация веществ в трансгенной культуре составляет 2,6 мг на 1 г сухих корней для гармина и

1,03 мг для гармалола, что в 20 и

2 раза (соответственно) ниже концент- 15 рации алкалоидов в корнях проростков гармалы. Учитывая, что вес 3-недельной трансгенной культуры в одной колбе в среднем в 300 раз выше, чем вес корня одного проростка гармалы, об- 2О щая .продуктивнрсть полученной культуры выше продуктивности проростков в 20 раз по гармину и в 165 раз по гармалолу.

Отличием трансгенной культуры 25 гармалы является также ее непрерывный рост и возможность планируемого выращивания растительного сырья в любое время года.

Использование в качестве исходного материала проростков гармалы обыкновенной из семян, полученных иэ

Способ получения,б -карболиновых алкалоидов из гармалы обыкновенной, включающий индукцию ризогенеэа в клетках гармалы, выращивание полученной ризогенной культуры и выделение иэ нее алкалоидов, о .т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения эффективности способа за счет полученйя постоянно растущей культуры гармалы обыкновенной, сохраняющей способность к синтезу алкалоидов на уровне целого растения, индукцию риэогенеза осуществляют путем инфицирования сегментов гипокотиля стерильных проростков вирулентным штаммом Agrobacterium rhizogenes А-4, несущим

RL-плазмиду.