Способ стабилизации рекомбинантного фактора некроза опухоли

 

Изобретение относится к белковой инженерии, в частности к стабилизации фактора некроза опухоли,полученного генно-инженерным путем. Способ стабилизации физиологически активного соединения включает прибавление альбумина к водному раствору фактора некроза опухоли, который получают в результате культивирования штамма ESCHERICHIA COLI, трансформированного рекомбинантной плазмидной ДНК PHTNF LAC UV 5-2 с последующим культивированием и выделением конечного продукта. 6 табл.

I»» 1»

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИ4ЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (gI)g С 12 N 15/28

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Чаl Ala His Val Val

Ala Asn Pro Gln Alа Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Agr

Ala Asn Аlа

Leu Leu Ala Asn Gly

Pro Ser Glu Gly Leu

Val Glu Leu

Arg Asp Asn Gln

Tyr Ser Gln Val

Leu Val Val

Tyr Leu lie

Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr (21) 3918201/30-13 (22) 06.06.85 ф (3!) 59-115496 (32) 07.06.84 (33) JP (46) 15.11..90. Бюл. N- 42 (71) Асахи Касеи Когио Кабусики Кайся (JP) (72) Хадзиму Сакамото, Такао Киета, Хиратака Итох и Хироси Хаяси (JP) (53) 3,5.224.2 (088.8) . (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ РЕКОИЬИНАНТНОГО ФАКТОРА НЕКРОЗА ОГРХОЛИ

Изобретение относится к белковой инженерии, в частности к стабилизации фактора некроза опухоли, полученного генно-инженерным путем..

Способ стабилизации физиологическ и ак тивно го соединения в ключ ае т прибавление альбумина к водному раствору или содержащему фактор некроза опухоли (ФНО), где указанное физиологически активное соединение получено с использованием рекомбинантной ДНК кодирующей фактор некроза опухоли, обладающий цитотоксическим действием на клетки Е-11 и способный вызывать

„,Я0„„1607690 А 5

2 (57) Изобретение относится к белковой инженерии, в частности к стабилизации фактора некроза опухоли, полученного генно-инженерным путем. Способ стабилизации физиологически активного соединения включает прибавление альбумина к водному раствору фактора некроза опухоли, который по— лучают в результате культивирования штамма Escherichia coli, трансформированного рекомбинантной плазмидной

ДНК рНТ I

Фактор некроза опухоли получают обычным методом рекомбинантнь|х ДНК с использованием рекомбинантной ДНК, кодирующей физиологически активное соединение. При испытании ФНО проявляет цитотоксическую активность против клеток L-N и вызывает геморрагический некроз трансплантированной мышам BALB/C саркомы NethA. ФНО характеризуется следующей последовательностью аминокислот.

l607690

His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr С1п Thr Lys 1 а1 Asn

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu

Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Пе Tyr Leu Gly Gly

Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn

Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe

Gly Ile Ile Ala Leu ет следующую структуру:

ТСА ТСТ ТСТ CGA ACC CCG AGT GAC AAG ССТ GTA ССС САТ GTT GTA

GCA AAC ССТ САА GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG ААС CGC CGG

GCC ААТ GCC СТС CTG GCC ААТ GGC GTG GAG CTG AGA GAT ААС CAG

CTG GTG GTG ССА ТСА GAG GGC CTG ТАС СТС АТС ТАС ТСС CAG GTC

СТС ТТС AAG GGC CAA GGC TGC ССС ТСС АСС САТ GTG СТС СТС АСС

САС ACC ATC AGC ССС АТС GCC GTC ТСС ТАС CAG АСС ААС GTC AAC

CTC CTC ТСТ GCC АТС AAG АСС ССС ТСС CAG AGG GAG АСС CCA GAG

GGG GCT GAG GCC AAG ССС TGG ТАТ GAG ССС ATC ТАТ СТС GGA GGG

GTC ТТС CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA СТС AGC ССТ GAG АТС AAT

CGG ССС GAC ТАТ СТС GAC ТТТ GCC GAG TCT GGG САС GTC ТАС ТТТ

GGG АТС АТТ GCC CTG, а фрагмент ДНК, кодирующий ФНО, имеДанный полипептид получают следующим образом.

Ткань поджелудочной железы человека или кролика измельчают до вымрро1 женно ro порошка, депротекниэируют, в результате осаждения получают высокомолекулярную кроличью или челове- ческую ДНК; высокомолекулярную ДНК частично расщепляют ; фрагменты ДНК фракционируют по размерам и выделяют фрагмент размером 5000-20000 пар оснований (по); фрагменты, полученные на предыдущей стадии, клонируют с использованием вектора фага

Charon 4А; получают библиотеку ДНК человека или кролика в фаге.

1. В к-ДНК кроличьего ФНО вводят радиоактивную метку 32 по способу

55 тр ан сл я ции.

2. Каждый из геномных наборов бактериофаг 9 /кролик и бактериофаг

®человек отбирают для гибридизации с помощью 32 P-меченной к-ДНК кроличьего ФНО.

3. Из соответствующих клонов выделяют ДНК, составляют ее рестрикционную карту и анализируют гибридизацией по Sautheres.

Полученные в результате гидролиза рестриктазой фрагменты, содержащие гены кроличьего или человеческого

ФНО, субклонируют в плазмидные векторы и затем определяют в них последовательность оснований.

4. Последовательность оснований в к-ДНК кроличьего ФНО сравнивают с последовательностью оснований в гене кроличьего ФНО и определяют экзоны и интроны в гене кроличьего ФНО .

5. После этого последовательность оснований гена человеческого ФНО сравнивают с последовательностью ос1607690 нований гена кроличьего ФНО и определяют экзоны и интроны гена человеческого ФНО.

6, Подтверждают, что аминокислотная последовательность кроличьего

ФНО, рассчитанная из последовательности оснований, полученной удалением интронов гена кроличьего ФНО в комбинированном его экзонов,согласуется с аминокислотной последовательностью, рассчитанной из последовательности оснований к-ДНК кроличьего

ФНО .

7. Затем аминокислотную последовательность физиологически активного соединения, используемого в изобретении, рассчитывают из последовательности оснований ДНК, кодирующей физиологически активное соединение,полученной удалением интронов гена, кодирующеro физиологически активное соединение, и соединением его экзонов. Подтверждают, что аминокислотная последовательность физиологически активного соединения частично согласуется с аминокислотной последовательностью кроличьего <>HO °

3. Пс сле этого ДНК, кодирующую физиологически активное соединение, модифицируют по концам in vitro для введения соответствующего носителя экспрессии и получения рекомбинантной

ДНК, содержащей кодирующую ДНК, Рекомбинантную ДНК используют для трансформаций клетки-хозяина, которая, в свою очередь, может расти в культуре и эксрессировать целевое физиологически активное соединение.

9. Полученное таким образом физиологически активное соединение в своей полной форме имеет 155 аминокислотных остатков, начинающихся с серина. Если оно в своей последовательности-предшественнике имеет сигнальный пептид, то этот сигнальный пептид имеет сильно гидрофобный характер.

Полученный таким образом трансформированный организм культивируют в широких масштабах обычным способом с получением ФНО. После этого супернатант культуры или клеточный экстракт собирают и получают ФНО.

Полученный ФНО очищают с использованием либо с помощью обычных биохимических методик, с получением водного раствора ФНО, который лио5

1О фильно высушивают и получают порошок очищенного ФНО.Очистку ФНО осуществляют путем высаливания с исполь зованием сульфата аммония, ионообмен ной хроматографии с использованием анионообменной смолы, гель-фильтрации и электрофореза.

Апьбумин прибавляют к раствору в количестве приблизительно 1 мкг или больше, предпочтительно 10 мкг или больше, особенно предпочтительно

100 мкг или больше, на 1 мл раствора, имеющего цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-!!

Ф равную 10 — 10 ед./мл (единица активности будет определена ниже) . Верхний предел количества альбумина обычно определяют по его растворимости

20 и вязкости результирующего раствора.

Верхний предел количества альбумина как правило равен 50 или 10 мг на

I мл раствора ФНО. Если ФНО стабилизируют в форме порошка, то альбумин

25 прибавляют к порошку в таком количестве, чтобы водный раствор, получаемый растворением порошкообразного физиологически активного соединения . и имеющий активность 10+10 ед,/мл, 30 имел вышеуказанные концентрации альбумина.

Способ, .которым прибавляют альбумин, не играет существенной роли.

Например, альбумин в порошкообразной форме можно непосредственно прибавлять к раствору активного соединения. Кроме того, порошкообраэный альбумин для удобства может быть растворен в воде или подходящем буфе4п ре и прибавлен к раствору. Порошкое образный альбумин также может быть смешан с порошком активного соединения. Прибавление альбумина может быть осуществлено в любой момент

45 стадии очистки или стадии получения фармацевтич еских рецептур.

ДНК из тимуса теленка/SS PE:

0,18 M NaC1+10 MM NaH

ЭДТУ, рН 7,4.

СХФ вЂ” среда хранения фага, содержащая 5,3 г NaC1, 2 r MgSOq 7HqO, 50 мл 1 H трис-НС1 (рН 7,5) и 5 мл

2Z.-ного раствора желатины на 1 л.

МЕ-Бульон: среда, содержащая 10 г

NZ-амина, 5 г НаС1 и 2 r MgSO 7H O (NZ-амин представляет собой типа АЧ гидролизат казеина, производимый и поставляемый Humko Shef field Chemiсаl Durnon of Kraft, Gnc., CPIA).

1607690

ИПТГ: изопропилтиогалактозид. х-гал: 5-дибром-4-хлор-3-индолилгелактозид.

ТА3; 0,04 М Трис-ацетат (рН 8,0)

0,002 М ЭДТУ.

5 х раствор Денхард ra: водный раствор, содержащий 1000 мг Ficoll

1000 мг поливинилпирролидона и

1000 мг БСА в 1 л. п,о,: пара оснований.

Пример 1. Крольчихам массой

2,5-3 кг инъекцией в ушную вену вводят по 50 мг убитых формалином Propionebacterium acnes (Corynebacterium parvum, Wellcome Research Laboratories Англия). Через 8 дней снова через ушную вену вводят 100 мкг эндотоксина (дипополисахарид из Escherichia coli 026:В6, производство

Difco Laboratories, Сп1А, через 2 ч из сердца отбирают цельную кровь. К полученной крови прибавляют гепаринат натрия в количестве 100 ед. на

100 мл. Затем кровь центрифугируют 25 при охлаждении со скоростью 5000 об/

/мин в течение 30 мин для удаления клеток крови и нерастворимых твердых соединений, В результате из 40 кроликов получают плазму (2,4 л), имеющую 30 цитотоксическую активность сывороточного ФНО, равную Зх!О ед,/мл.

К плазме (2,4 л) прибавляют 24 r цеолита. Результируюг!ую смесь перемешивают H течение 1 ч, после чего отфильтровывают, фильтрат смешивают

35 с 1,2 л буфера 0,04 M Трис-НС1 (рН

7,8) и наносят на колонку с DEAESpharose CL-6В, тщательно уравновешенную против 0,04 M Трис-НС1 буфера 40 (рН 7,3), содержащего 0,1 М NaC1

Колонку промывают 0,04 M Tpuc-HCl буфером и адсорбированный ФНО элюируют 0,04 M Трис-НС1 буфером (рН 7,2), содержащим 0,18 M 11аС1, Фракции,проявляющие цитотоксическую активность против L-клеток, концентрируют ультрафильтрацией. Полученный таким образом концентрат наносят на колонку с Sephacryl S-200, тщательно уравно50 вешенную против 5 мМ фосфатного буфера, и подвергают гель-фильтрации с использованием этого же буфера. Активные фракции концентрируют ультрафильтрацией и получают очищенный

ФНО, имеющий активность 3,5xl0 ед.

6 5 и удельную активность 18х10 ед./мг, Кроличий сывороточный ФНО смешивают с полным стимулятором Фрейнда (1:1) и подкожно вводят в спину мышам-самцам Ва ЬВ/С, имеющим возраст

12 недель. Вышеуказанную операцию повторяют через 2 и 4 недели после первоначальной инъекции. Через 1 неделю после последней инъекции отбирают цельную кровь, Из отобранной крови получают сыворотку.

Полученную таким образом сыворотку прибавляют к культуральной среде для оценки цитотоксической активности ФНО против L — клеток в таком количестве, чтобы результирующая концентрация соответствовала 500-кратному разбавлению. Цитотоксическую активность кроличьего сывороточного

ФНО против L-клеток измеряют так, как описано вьнпе. Устанавливают,что кроличий сывороточный ФНО не проявляет цитотоксической активности против L-клеток. Из этого результата можно сделать вывод о том, что полученная на этой стадии мьппиная сыворотка содержит антитело к кроличьему сывороточному ФНО (далее обозначают как анти †Ф ан итело) °

Крольчихам внутривенной инъекцией вводят убитые формалином клетки

Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum, Wel1come Pesearch

Laboratories, Англия), Через 7 дней кроликов подвергают трехестомии,легкие промывают физиологическим солевым раствором и получают таким образом всплывающие клетки. Полученные таким образом клетки промывают физиологическим солевым раствором. C использованием культуральной среды

RPM1 1640s содержащей 10 об.7 заро дьппевой телячьей сыворотки, клетки инкубируют при 37 С в воздухе,содержащем 57. углекислого газа. Клеточную культуру разделяют на две группы и к одной из них прибавляют эндотоксин, полученный из Е.coli (липополисахарид из Е.coli 026: В6), в концентрации 10 мкг/мл. К другой группе приб авляют такое же к оличес тво дистиллированной воды. Супернатант клеточной культуры, к которой прибавлен эндотоксин, проявляет цитотоксическую активность против Ьклеток, и активность достигает максимума в течение 7 ч. Эта .активность подавляется анти-ФНО антителом, но не подавляется нормальной мьппиной сывороткой .

16

Кроме того, супернатант клеточной культуры, к которой не прибавляли эндотоксин, не проявляет цитотоксичности против L-клеток.

К клеточной культуре, к которой прибавлен эндотоксин, дополнительно прибавляют радиоактивный L-/35S)-метонин (1300 кюри/ммоль, в количестве 1 милликюри/мл), Супернантант анализируют электрофорезом на полиакриламидном геле с Д".Н в соответствии со способом Laemmli. Концентрацию геля доводят до 12,5 мас.7. После электрофореза гель обрабатывают с помощью Е11НАНСЕ и после высушивания экспонируют на рентгеновскую пленку. Устанавливают, что в супернатанте клеточной культуры в присутствии эндотоксина образуется соединение, имеющее молекулярный вес около

17500.

Супернатант каждой клеточной культуры Подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле с ДСН так же, как описано выше. После этого гель встряхивают в 2,57. †н ЯР 40® в течение 1 ч и затем в воде в .течение

2 ч. После встрахивания каждую полосу ми. рации отделяют вырезанием и режут на полоски шириной 2 мм в направлении, перпендикулярном направлению миграции. Каждую полоску культивируют с L êëåòêàìè и оценивают цитотоксическую активность по отношению к L-клеткам, В той полосе, где микрировали супернатант клеточной культуры, содержащей эндотоксин,цитотоксическую активность против L-клеток обнаруживают в положении, соответствующем молекулярному весу 17500, В других положениях цитотоксичность не обнаруживают.

Клеточную культуру инкубируют в течение 2 ч после прибавления эндотоксина, после чего центрифугируют и собирают клетки. Экстракцию цитоплазматической PHK из собранных клеток, экстракцию м-PHK проводят из цитоплазматической РНК. К Зх10 кл. прибавляют 4 мл 4 M раствора гуанидинтиоцианата и смесь измельчают с .помощью гомогенизатора. Остатки удаляют центрифугированием и растворяют в смеси 2,4 г хлорида цезия. Смесь осторожно выливают в полиалломерную пробирку, куда предварительно прибавляют 2,5 мл раствора, содержащего

5,7 M хлорид цезия и 0,1 M ЭДТУ (рН

7,5), и затем подвергают ультрацентрифугированию при 30000 об/мин в течение 12 ч при 20 С. После прибавле5 ния супернатанта осадок растворяют в 1 мл 10 мМ буфера Трис-НС1, содержащего 5 мМ ЭдТУ и 17 мас./об.7 ДСН.

Результирующий раствор экстрагируют смесью хлороформ: I-бутанол (4:! по объему) . К водной фазе прибавляют

0,05 объема 2 М ацетата натрия и

2,5 объема этанола и оставляют стоять при 20 С в течение 2 ч или дольше, в результате чего РНК выпадает в осадок. Осадок собирают центрифугированием, сушат и растворяют в 500 мкл стерильной воды. В результате получают раствор цитоплазматической PHK.

Полученный раствор РНК нагревают

20 при 68 С в течение 2 мин, а затем быстро охлаждают. К раствору прибавляют 500 мкл 10 мМ буфера Трис-ЭДТУ двухкратной концентрации (рН 7,4), смесь наносят на 200 мг олиго-d-T25 целлюлозы, набитой в колонку, и промывают 10 мл того же самого буфера (единократной концентрации). Оставшееся в колонке соединение элюируют

2 мл элюирующего буфера, содержащего

3р 10 мИ Трис-НСI буфер (рН 7,4), 1 мМ

ЭДТУ и 0,1 мас./об.7 ДСН. К элюенту прибавляют 0,05 объема ацетата натрия и 2,5 объема этанола и смесь охлаждают при -20 С для образования о осадка. Осадок собирают центрифугиро35 ванием, наносят на колонку с олигоd — I — целлюлозой и собирают фракции, адсорбирующиеся на олиго-d-T-целлюлозе. Выделяют 85 мкг м-РНК, как пока40 зывает анализ ультрафиолетового спектра.

880 мкг РНК растворяют в 250 мл воды, и результирующий раствор слоем наносят на 10 мл 5-257.-ного линейно45 го сахарозного градиента плотности.

Градиент плотности сахарозы получают с использованием Трис-буферных растворов, содержащих 25 мИ Трис-НС1 (рН 7,2), 2 мМ ЭДТУ, 1 мас./об.X ДСН и соответственно 5 и 257 сахароэы.

Проводят ультрацентрифугирование при 40000 об/мин в течение 12 ч при

4 С и отбирают фракции, каждая из коо торых имеет объем 400 мкл, с помощью аппарата выделения фракций, после чего проводят осаждение этанолом.Осажденные фракции центрифугируют и растворяют в стерильной воде. менты, отщепленные трипсином.

ФНО высокой степени очистки и его, отщепленные трипсином фрагменты обес— соливают на колонке с Sephadex-25, после чего лиофильна высушивают. Очищенный ФНО и отщепленные трипсином фрагменты подвергают разложению по

Эдману с N-окончания. Каждую отщепляемую аминокислоту на каждой стадии анализируют обычным способом с помощью хроматографа высокого давления, модель $Р8100. В результате устанавливают, что ФНО имеет следующую Ч—

20 концевую аминокислотную последовательность: Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-LeuSer-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-ValAla-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Glu-LeuGln-.

25 Один из отщепленных трипсином фрагментов имеет следующую концевую аминокислотную последовательность:

Glu-Ths-Pro-Glu-Glu-А1а-Glu-Pro-МetAla.

30 Олигодезоксинуклеотиды, компле— ментарные к последовательности оснований м — РНК, рассчитанной из амино. кислотной последовательности кроличьего ФНО, синтезируют в соответ— ствии с усовершенствованным фосфотри— эфирным способом ° При получении олигодезоксинуклеотндов, 128 олигодезоксинуклеотидов, рассчитанных из аминокислотной последовательности

4п кроличьего ФНО, классифицируют по пяти группам, а именно группам 16, l6 32, 32 и 32, и синтезируют в виде смесей олигодезоксинуклеотидов соответствующих групп. С полученных

45 олигодезоксинуклеотидов соответствующих групп снимают защиту обычным способом и их очищают колоночной хроматографией на Sephadex-50 электрофорезом на 20 мас.7. полиакриламид— ном геле, содержащем 7 М мочевину, и колоночной хроматографией с использованием Е52. Полученные таким обра3оМ олигодезоксинуклеотиды сооТВеТ ствующих групп подвергают диализу против буФерного раствора 0,1 мМ

Трис-ЭДТУ.

В каждый из очищенных олигодезоксинуклеотидов соответствующих групп вводят радиоактивную метку с исполь11 !60

Проводят трансляцию м-РНК с использованием осцитов Xenopus laevis

Фракционнрованную м-РНК растворяют и стерильной воде с получением концентрации 1 мкг/мкл и раствор вводя в социты в небольшом количестве (50 нл на клетку), Затем клетки культивируют 24 ч в растворе Барса (содержит 7,5 мМ Трис-НС1, рН 7,6, 88 мМ ИаС1, 1 мМ КС1, 0,33 мМ нитрата кальция, 0,41 мМ хлорида кальция, 0,82 мМ сульфата магния, 2,4 мМ бикарбоната натрия, 18 ед/мл пеницил— лина G и 18 мкг/мл стрептомицина), содержащем бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мг/мл. Осциты измельчают в культуральной среде с помощью стеклянной палочки. После этого культуральную жидкость центрифугируют и супернатант испьггывают на цитотоксическую активность против

L-клеток, м-PHK транслируемая с получением полипептида, обладающего максимальной активностью, по данным седиментационного анализа имеет размер 16S, Активность подавляется анти-ФНО антителом.

С использованием 5 мкг фракционированной м-PHK получают двунитиевую

ДНК. Двунитиевую ДНК фракционируют по размерам на 3,57.-ном полиакриламидном геле и получают 530 нг фракции, имеющей размер приблизительно !

000-2000 п.о. 7 нг этой фракции удлиняют дезокси-С-остатками с использованием концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы, ренатурируют с по мощью 56 нг плазмиды рВе 322,которую расщепляют PstI, и удлиняют остатками лезокси-С, Ренатурированную таким образом смесь вводят в штамп !

?.coli К-12 (НВ!01, АТСС 33694) для трансформации штамма. В результате получают 12000 трансформированных организмов.

Кроличий ФНО подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле с до децилсульфатом !а для очистки, Часть

:".еля окрашивается Кумасси бриллианто вым голубым, Полосу в месте,соответ=твующем молекулярному весу 17000, зырезают из геля и экстрагируют

17-ным раствором бикарбоната аммония

В виде белка выделяют приблизительно 180 мкг ФНО.

150 мкг выделенного ФНО растворяют в 75 мкг !Е-ного раствора бикарбоната аммония, после чего прибавля7690 ют 3 мкг трипсина TPCK. Смесь инкчбируют при 37 С в течение 4 ч, После этого смесь фракционируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления на колонке и получают фраг13

)6 зованием Т вЂ” полинуклеотидкиназы и

32Р-аденозинтрифосфата по известной методике и затем очищают колоночной хроматографией с использованием

DE52. Радиоактивное соединение вводят в каждый иэ нуклеотидов соответствующих групп в количестве приблив зительно Зх10 имп/мин на 1 мкг. м — PHK клеток, вырабатывающих ФНО, обрабатывают раствором, содержащим

1 И глиоксаль, 10 мЧ NaHgO и

50 об.7 диметилсульфоксида, при 50+C в течение 60 мин и затем фракционируют с использованием электрофореза на 1,1 мас.7 агарозном геле. Фракционированную м-РНК переносят на фильтр электрофоретического типа для получения отпечатков. После этого м-РНК на фильтр обрабатывают раствором 5 х раствор Денхардта, содержащим раствор 5 х SSC, 0,75 M NaC1 + 0,075 И цитрат натрия, -рН 7 ° 150 мкг/мл денатурированной лососевой сперматоэоидной ДНК, при 65 С в течение 2 ч и затем обрабатывают раствором 5 х р-р

Денхардта, содержащим Iх10 имп/мин

7 на 1 мл меченых олигодеэоксинуклеотидов, и раствором 5 x SSC npu

50 С в течение 2 ч. Полученный таким образом фильтр промывают раствором

6 х SSC (0,9 М 11аС1 + 0,09 М цитрат натрия), рН 7, четыре раза,последова— тельно при комнатной температуре, 40, 50 и 60 С. Устанавливают, что олигодезоксинуклеотиды, обозначенные как проба MI наиболее сильно гибридизуются с м-РНК, зто указывает на то, что олигодезоксинуклеотид, имеющий последовательность оснований, полностью комплементарную,м-PHK,содержится в олигодезоксинуклеотидах, обозначенных как проба MI. ДНК трансформированных организмов гибридизус ют с меченым олигодезоксинуклеотидом (пробой MI) . Отбирают 49 колоний, сильно гибридизирующихся с мечеными олигодезоксинуклеотидами (проба MI) и затем фиксируют на другом нитроцеллюлозном фильтре. После этого с использованием 49 колоний проводят дальнейшую гибридизацию и отбирают

9 колоний, наиболее сильно гибридизуемых мечеными олигодезоксинуклеоти- дами (пробой MI), Из 9-ти колоний получают приблизительно по 5 мкг плазмид, Каждую из полученных плазмид расщепляют с использованием рестрикционных фермен07690

14 тов ?st l, TaqI, RsaI и PvuII, После этого фрагмейты, полученные расщеплением с помощью соответствующих рестрикционных ферментов, сравнивают с учетом их длины.

Результаты показывают, что все девять штаммов, соответствующих девяти колониям, имеют последователЬность оснований фрагмента, отщепляемого PvuII u RsaI и состоящего иэ приблизительно 50 п.о., и что большинство иэ 9 штаммов содержат последовательность оснований фрагмента, отщепляемого RsaI и состоящего из приблизительно 200 п.о. Результаты свидетельствуют о том, что девять ./ штаммов имеют частично одинаковую последовательностЬ оснований.

20 Семь штаммов, содержащих плаэмиды, указанные в табл.1, отдельно культивируют в 2 мл LB-среды, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина, до тех пор, пока оптическая плотность растворов не достигнет значений, укаэанных в табл.I после чего проводят центрифугирование и получают соответ,ствующие штаммы. Каждый из полученных штаммов отдельно прибавляют к

30 2 мл физиологического солевого раствора и разрушают ультразвуком. Полученные растворы центрифугируют и определяют цитотоксическую активность полученных супернатантов против Ь клеток. Результаты представлены в табл,I. 3 пустом опыте воспроизводят вышеуказанную методику с использованием штамма, содержащего плаэмиду

pBR 322.

4р Цитотоксическая активность против

L-клеток подавляется анти-ФНО антителом, но не подавляется нормальной с мышиной сывороткой. Это указывает на

В то, что все девять вышеуказанных ко45 лоний имеют плаз иды, содержащие олигодезоксинуклеотиды, кодирующие ФНО.

Штаммы Е.coli, содержащие плазмиды рВ 2-7 и pR 13, культивируют в

1 л среды И9, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина. Плаэмиды выделяют в количестве приблизительно 150 мкг.

Последовательность оснований вставки каждой плазмиды определяют по химической методике 11аксама-Гильберта.

Таким образом, выясняют полную последовательность кроличьего ФНО.

На этой стадии проводят конструирование плазмиды с использованием рекомбинантной плазмиды pR 12 с йолу15!

607690!

6 чением прямой экспрессии ФНО в Е. coli с использованием lac в качестве промотора. Первые 10 мкг плазмиды

pR 12 расщепляют с помощью 10 ед, Apa I при 37 С в течение 2 ч и подвергают электрофорезу на 4 мас.7 полиакриламйдном геле, выделяя фрагмен1 ты длиной 610 п.о. Путем электроэлюирования из геля выделяют приблизительно 1 мкг фрагментов.

Синтезируют два олигодезоксинуклеотида; 5! -GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC3 и 5 1-ССАСЛАССТСАСАТСЗ . После этого каждое 5! -окойчание олигодезокси- 15 нуклеотидов (приблизительна 00 пикомоль) фосфорилируют с использованием Т4 — полинуклеотидкиназы. После завершения реакции реакционную смесь экстрагируют фенолом и затем хлоро- 20 формом. Затем полученные синтетичес— кие олигомеры смешивают с 0,5 мкг Ара

I-фрагмента длиной 630 п.о, и проводят высаживание этанолом. Фрагменты связывают с синтетическими олигомера- 25 ми при 4 С в течение ночи с использованием 10 ед. Т -ЛНК-лигазы. После завершения реакции реакционную смесь осаждают этанолом и расщепляют 20 ед.

BamHI при 37 С в течение 3 ч, после 30 чего проводят электрофорез на 4 мас.7 полиакриламидном геле и электроэлюированием выделяют фрагменты длиной

670 п.о. 1 мкг коммерчески доступной плазмиды-pUC-8 Расщепляют с помощью

BamHI, экстрагируют фенолом, затем хлороформом, после чего осаждают этанолом и получают вектор. 0,5 мкг полученного вектора связывают с помощью

Т4-ДНК-лигазы с получением вьнпе фрагментом, имеющим сай гы BamHI на обоих концах и содержащим приблизительно

670 пар оснований, кодирующих ФНО.

Е.coli H101 трансформируют с использованием полученного выше вектора и 45 культивируют на агаровой среде,содержащей мМ ИПТГ и 0,004 (мас./об.)

x — гал, с получением приблизительно

200 белых колоний. Из 100 этих трансформированных организмов получают плазмидную ДНК и расщепляют ее с помощью ВатпН1. В результате устанавливают, что 15 плазмид содержат, как и предполагалось, BamHI-фрагмент (около 670 п.о.). Для проверки направления инсерции 15 вьппеуказанных плазмид расщепляют,co RI имеющей лишь один сайт узнавания в pUC-8 и PVUII имеющий лишь один сайт узнавания в фрагменте длиной приблизительно 670 пар оснований, и подвергают электрофорезу на б мас.7 полиакриламидном геле. В результате устанавливают,что

7 плазмид имеют, как и предполагалось, фрагмент, состоящий из приблизительно 140 п.о., и что направление транскрипции промотора lас íà pUC-8 согласуется с направлением транскрипции олигодезоксинуклеотидов, кодирующих

ФНО °

Анализ последовательности ПНК показывают, что / плазмид имеют одинаковые последовательности и содержат нужную нуклеотидную последовательность в переходах между lас-промотором, синтетической ДНК и к-ДНК.

Конструирование других плазмид проводят с использованием рекомбинантной плазмиды pR 17 с получением прямой экспрессии ФНО в F..coli c использованием 1асГ/ 5 в качестве промотора. Сначала 10 мкг плазмиды

pR 17 Расщепляют 1О ед. ApaI npu

37 С в течение 2 ч, годвергают электрофорезу на 4 мас.7. полиакриламидном геле и выделяют фрагменты, содержащие приблизительно 630 п.о. 11римерно

l мкг фрагментов выделяют из геля электроэлюированием. Синтезируют два олигодезоксинуклеотида: 5

AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3 и 5

CGAGAAGCTGACATG-3 . После этого каждое из 5 -окончаний этих двух олигодезоксинуклеотидов (приблизительно

100 пикомоль) фосфорилируют с использованием Тп — полинуклеотидкиназы. После завершения реакции реакционную смесь экстрагируют фенолом, а затем хлороформом, Далее синтетические олигомеры смешивают с 0,5 мкг предварительно полученного из плазмиды pR 17 и осажденного этанолом ApaI-фрагмента (приблизительно 630 п,с.). Фрагмент связывают с синтетическими олигомерами при 4 С в течение ночи с использованием 10 ед. Т4-лигазы.После завершения реакции реакционную смесь осаждают этанолом, расщепляют

20 ед. EcoRI при 37 С в течение 3 ч и затем проводят электрофорез на

4 мас.7. полиакриламидном геле и электроэлюированием выделяют фрагмент (приблизительно 670 и.о.).

1 мкг РОР95-15 расщепляют с лов мощью FcoRI, экстрагируют фенолом, затем хлороформом, после чего осаждают этанолом и получают вектор. С

16076 использованием Т4.-ДНК-лигаэы 0,5 мкг полученного вектора связывают с фрагментом (около 670 п.о.), полученным связыванием синтетического олигонуклеотида с олигонуклеотидом, 5 кодирующим ФНО. 1М101 (АТСС 33876) трансформируют с использованием полученного вьппе вектора и культивируют н среде, содержащей 1 м!! ИПТГ и !р

0,004% (мас./об) х-гал, с получением приблизительно 150 малых колоний.

Плазмидную ДНК получают из 100 этих колоний и расщепляют с помощью

EcoRI. В резул;тате устанавливают, что 12 плазмид содержат предполагаемый EcoRI-фрагмент (приблизительно

670 п.о,). Для проверки направления инсерции 12 вьппеуказанных плазмид расщепляют с помощью Рчц1? и Pstl и подвергают электрофорезу на

1,5 мас.% агарозном геле. В результате устанавливают, что четыре ггпазмиды содержат целевые фрагменты (приблизительно 1280 п.о, и прибли- 25 зительно 2600 п.о.) и что направление транскрипции промотора lac UV5 согласуется с направлением транскриггции олигодезоксинуклеотидов,кодирующих ФНО. 30

Ана из последовательности оснований показывает, что эти четыре плазмиды имеют одинаковую последовательность и что промотор lac UV5, синтетический олигодезоксинуклеотид и к-ДНК соответствующим образом соче20

Количество мышей, совершенно излечившихся от опухоли

Доля выздоровевших

Количество мышей, использованных для испытdния гируют и суспендируют в смеси 2 мл

45 вышеуказанной смеси, содержащей

0,1 M МОПС (рН 6,5), 50 мМ САС1, 10 мМ КЪС1 и 30 мкл ДМСО. К аликвоте результирующей суспензии объемом

200 мкл отдельно прибавляют по 10 мкл

5р каждого из растворов плазмидной ДЙК.

Каждую из результирующей смесей ох. ° лаждают на льду в течение 30 мин и затем нагревают при 44 С в течение

60 с. Непосредственно после этого

55 к каждой из нагретых смесей прибавляют по 5 мл предварительно нагретой до 37 С LB-среды, после чего проводят инкубирование при 37 С в течение

1 ч, Каждый из полученных культуральРезультаты представлены в табл.2.

Пример 2. Колонии E.coli К12 штамма МС1061 трансформируют плазмидами pR 18, рВ 2-7 и рЕ 2-2. Колонию штамма МС1061 Е.coli культивиру- . ют в среде ЬВ до тех пор, пока оптическая плотность культурального бульона при 550 нм не достигнет значения 0,3.50 мп выросшей культуры

Е.coli собирают, промывают 25 мл .смеси, содержащей 10 мМ МОПС (рН 6,5) и 10 MM RbCl, и снова суспендируют в 25 мл смеси, содержащей 0,1 M МОПС (рН 6,5), 50 мМ СаС10 и 10 MM RbC1.

Результирующую суспензию охлаждают на льду в течение 30 мин, центрифутаются друг с другом. Полученные плаэмиды обозначают как рФНО lас

UV " — 1.

Штаммы Е.coli, содержащие плазмиды, культивируют в 50 мл ЬВ-среды, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, при 37 С в течение ночи ° Затем штаммы переносят в 5 л

LB-среды, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и дополнительно культивируют при 37 С в течение 3 ч. К ней прибавляют изопропил †-D-тиогалактопиранозид в результирующей концентрации 1 мМ. Культивирование продолжают еще в течение

6 ч, после чего проводят охлаждение.

3атем штаммы собирают центрифугированием. Прибавляют в 5 л буферного раствора 0,04 I". Трис-НС1 (рН 7,8), разрушают ультразвуком и получают раствор белков штамма. Полученный раствор обладает цитотоксической активностью против L-клеток, равной

5x I 07 ед. /л.

Полученный раствор очищают таким же образом и получают 1,2х10 ед.

ФНО. Удельная активность ФНО равна

6,8х10г ед./мг.

Образец (0,2 мл) ФНО испытывают способом анализа in vivo.

Через 20 дней после инъекции образца делают осмотр дегенерации опухолей и рассчитывают долю выздоро— вевших по следующей формуле.

07690 20

19

16 ных бульонов центрифугируют с образованием клеточного осадка. Супернатант отбрасывают, прибавляют LBсреду и каждый из клеточных осадков суспендируют перемешиванием, Каждую из результирующих суспензий высевают на LB-пластинку агара, содержащую тетрациклин в концентрации 30 мкг/мл, и затем инкубируют при 37 С в течение ночи. В результате получают колонии трансформированных организмов, устойчивых к действию тетрациклина, каждая из которых трансформирована плазмидами pR 18, рВ 2 — 7 и рВ 2-2.

Трансформированные штаммы плаэмидами рБ 2-7 и pR 18 подвергают следующим операциям: выращивания трансформированного организма, сбор и лизирование трансформированного организма и очистка плазмидной ДНК по методике. Каждый из трансформированных штаммов высевают в ЬВ-среду и инкубируют при 37 ОС и интенсивном встряхивании. Эту стадию повторяют для выращивания трансформированного организма и амплификации плазмнд.Культуру трансформированного организма собирают центрифугированием при

4000g в течение 10 мин при 4 С.Супернатант отбрасывают. Результирующий осадок промывают 100 мл охлажденного на ледяной бане НТЭ (0,1 М 11аС1, 10 мМ Трис-НС1, рН 7,8, и 1 мМ ЭДТУ) и лизируют кипячением с использованием 20 мг/мл лизоцима в 10 мМ ТрисНС1, рН 8,0. Вязкий продукт переносят в пробирку ультрацентрифуги и центрифугируют при 25000 об/мин в течение 30 мин при 4 С и получают раствор ДНК. Измеряют объем раствора

ДНК. На каждый миллилитр прибавляют точно 1 г твердого хлорида цезия и осторожно перемешивают до полного растворения соли. На каждые )О мл раствора хлорида цезия прибавляют

0,8 мл раствора бромистого этила (водный раствор с концентрацией

10 мг/мл). Результирующая плотность раствора равна 1,55 г/мл, а концентрация бромистого этила равна приблизительно 600 мкг/мл. Раствор хлорида цезия переносят в пробирку для центрифугирования и оставшуюся часть пробирки заполняют легким парафиновым маслом. Проводят центрифугирова— ние при 45000 об/мин в течение 36 ч при 20пС и получают две полосы ДНК, где верхняя полоса состоит из линей10

55 ной бактериальной ДНК и меченой кольцевой плаэмидной ДНК, а нижняя полоса состоит из замкнутой кольцевой плазмидной ДНК. Нижнюю полосу

ДНК собирают в стеклянную пробирку с помощью иглы для подкожных инъекций, введенной через боковую стенку пробирки. Бромистый этил удаляют и водную фазу подвергают диализу против ТА3. Раствор плазмидной ДНК обрабатывают PHK-азой и экстрагируют равным объемом фенола. Водную фазу слоев наносят на колонку, уравновешенную по отношению к ТАЗ (pH 8,0) и O,IZ ДСН.ДНК в колонке промывают и наносят ТЕ с 0,17 ДСН для сбора фракций. Фракции осаждают этанолом и получают чистую плазмидную ДНК.

По вьппеуказанной методике получают 250 мкг чистой ДНК плаэмиды рВ

2-7 и 134 мкг чистой ДНК плазмиды

pR 18.

ДНК плазмиды рВ 2-7 (40.мкг) расщепляют рестриктазой PstI и подвергают электрофорезу на 47-ном акриламидном геле. После электрофореза

ДНК окрашивают и нужную полосу вырезают для получения вставки PstI.

С использованием 500 нг выделенной вставки PstI проводят трансляцию с меткой и 80 пикомоль радиоактивного dCTP прибавляют в 25 мкл реакционной системы (при 400 кюри/ммоль). смеси, состоящей из 2,5 мкл раствора А (раствор dNTP), 2,5 мкл раствора В (500 нг испытуемой JIHK,а именно вставки PstI) 5 мкл меченой dCTP (3200 кюри/ммоль), 1,3 мкл ЙСТР без метки (65 пикомоль, 50 гмоль/мкл

dCTP), 11,2 мкл раствора Е (вода), всего 22,5 мкл, прибавляют 2,5 мкл раствора с ДНК-аэу 1, ДНК-полимеризу 1 и проводят реакцию при 15 С в течение 60 мин. После этого для прерывания реакции к результирующей смеси прибавляют в качестве носителя т-РНК, дважды переосажценную этанолом и растворенную в 500 мкл воды.

Идеальная активность на 1 мкг ДНК равна 9,3xIO имп/мин.

Т

Вьппеописанные операции повторяют также с чистой ДНК плазмиды pR 18 для проведения трансляции с меткой.

Удельная активность íà 1 мкг, IHK рав-, на 7х10 мин/мин.

80 мкг ДНК плазмиды рР. 18 расщепляют рестриктазой RsdI и подвергают электрофорезу на полиакриламидном

16076 геле. Указанные ниже полосы пелевых вставок вырезают и очищают на колонке: приблизительно 640 п.о., 3,77 мкг (выход 527), приблизительно

175 п.о., 1,77 мкг (выход 50Õ).

Указанную выше вставку, имеющую около 640 п.о., обозначают как 3 — фрагмент pR 18 (соответствует 3 -нетранслированному участку pR 18), а вышеуказанные приблизительно 175 п.о. обозначают как pR 18-cfr (соответствуют кодирующому участку рВ. 18).

Кроме того, вышеописанные опера- !5 ции повторяют с использованием рестриктаэ PstI u Ilstll вместо RsdI u получают следующую полосу: приблизительно 450 п .о., 3,65 мкг (выход 60X).

Эту вставку обозначают как 5 -фрагмент pR 18.

32

Меченую P вставку плазмиды рВ 2-7 используют в качестве гибридизационной пробы для отбора 10 негативных колоний бактериофага Gharon !

4А (геномной библиотеки человека получаемых в результате введения в

Е.coRI сайт связывания Charon 4А фрагментов определенных размеров частично расщепленной ДНК человека) . 30

При этом используют метод гибридизации негативных колоний. Поскольку не весь бактериофаг в исходной культуре содержит необходимый генетический материал для получения ФНО человека, используют пробу, имеющую последовательность оснований, комплементарную гену ФНО кролика. ДНК негативных колоний фага, содержащую желаемый генетический материал, и радио- 40 активную метку идентифицируют по проявляемой радиоактивности. Из набора выделяют 9 гибридизованных негативных колоний.

При этом используют следующие ме- 45 тодики и условия:

). Число негативных колоний: примерно lх10 (колоний.. примерно 4x)0)

6 колоний на чашку диаметром 150 мм).

2, Перенос с использованием цитроцеллюлозных фильтров .

3 . Гиб ридиз ация: доб авление

1,25 х 10 ипм/мин мл пробы вставки

5 рВ2 — 7, 42C, 19,5ч.

4. Промывка: 2 х SSC (0,30 М

NaCl + 0,030 М цитрат натрия, рН 7)

О, 1 7 додецилсульф ат а натрия при комнатной температуре. Погружение

10 мин х 4; 1 х SSC (0,15 М !)аС1

90 22

О,OI5 И цитрат натрия, рН 7) - О,tg додецилсульфат натрия при 50 С - погружение 30 мин х 2, 5. Выдержкя: для рентгеновской о пленки XAP-5 80 С, 2 усиливающих экрана, 39 ч.

В результате проведенного вьппе отбора были получены 12 потенциальных штаммов-кандидатов. С использованием описанного выше способа отбора проводят второй этап отбора, в результате чего были получены 9 штаммов, содержащих требуемый фрагмент. Затем с использованием укаэанных штаммов проводят третий этап отбора, в результате чего получают 9 штаммов, содержащих указанный фрагмент. С использованием этих штаммов, содержащих указанный фрагмент, проводят четвертый этап отбора, предназначенный для подтверждения того, что указанные 9 штаммов содержат требуемый фрагмент. Полученные в результате отбора 9 бактериофагов, содержащих требуемый фрагмент, получили обозначения соответственно HG-1 и HG-9.

Используют 106 негативных колоний бактериофага Charon 4А/геномной совокупности кролика, которые получают в результате применения расщепленной ДНК кролика, вместо расщепленной

ДНК человека ° При этом используют

6,7 х 10 негативных колоний бактериофага Charon (геномной библиотеки

6 кролика вместо 10 негативных колоний бактериофага Charon 4А) геномной библиотеки человека. В результате получают два штамма бактериофага (обозначенные.PG-1 и PG-2), содержащие ген ФНО генома кролика.

Получают ДНК бактериофагов HG-3, HG-6 и HG-7. бх10 о клеток Е.coli ЬЕ-392 (клетки хозяина) суспендируют в )8 мл. среды хранения фага и добавляют к ней Зхlд ед. образований негативных колоний бактериофага НГ-3 в результате чего осуществляют заражение

Е.coli в течение 20 мин при 37 С.Затем к полученной смеси добавляют 3 л !

Ю-бульона и культивируют при встряхивании в течение 23 ч при 37 С. К смеси добавляют 60 мл хлороформа,после чего культуру продолжают встряхивать в течение 30 мин. Затем к смеси добавляют хлористый натрий, доводя его концентрацию до конечного значения, равного М, после чего смесь

23

160 оставляют на 15 мин и центрифугируют, отбирая верхний слой ° После этого к смеси добавляют полиэтиленгликоль (молекулярный вес около 6000) в таком количестве, что концентрация полиэтиленгликоля составляет 107. (мас./об), и опять оставляют на 22 ч при 4 С.

Бактериофаги собирают после центрифугирования. Полученные бактериофаги переводят в суспенэию в 28 мл среды для хранения фага и добавляют к сус,пензии равный объем хлороформа, После ,перемешивания в течение 30 с реакционную смесь центрифугируют,получая в результате водную фазу. К указанной водной фазе добавляют среду хранения фага до общего объема 30 мл.

К полученной смеси затем добавляют

26,4 г хлористого цезия, который осторожно растворяют, после чего подвергают смесь разделению на ультрацентрифуге (45000 об/мин, 20 ч), получая бактериофаги в виде отдельного слоя. Полученную смесь, содержащую бактериофаги, диализируют с исполь— зованием растворов 10 мМ хлористого натрия — 50 мМ трис(гидроксиметил) аминометана (Трис-буфер) рН 8

10 мМ хлористого магния. После этого к смеси добавляют ЭДТУ, протеиназу

К и додецилсульфат натрия в таких количествах, чтобы их концентрации составили соответственно 20 мМ, 50 мкг/мл и 0,5Ж (мас./об), затем смесь обрабатывают при 65ОС в течение ч, после чего экстрагируют фенолом, смесью фенола и хлороформа (1:1 по объему) и затем хлороформом.

Получаемую при этом водную фазу диализируют с использованием раствора

10 мМ Трис-буфера (рН 8) - 1 мМ

ЭДТУ. Измерения поглощения в ультрафиолетовой области для полученной водной фазы свидетельствуют о том, что получают чистую ДНК бактериофага HG 3 °

Те же самые операции и в той же последовательности, что и описанные в случае получения ДНК бактериофага

HG-3, осуществляют с целью получения

ДНК бактериофагов HG-б и HG-7.

В результате получают 2920 мкг

HG 3, 1100 мкг HG 6 и 819 мкг HG 7.

Осуществляют анализ полученных

ДНК методом пятен по Саутерну. Методика и условия ее осуществления следующие:

24

1, ДНК: НС-3 825 нг каждая; НС-6

935 нг каждая„" НС-7 685 нг каждая:

2, расщепление с использованием различных рестрикционных энзимов:

10 ед BamHI ) О ед. FcoRI; 10 ед.

BamHI; 10 ед. EcoRI; 10 ед. HindIII;

10 ед. ЫпдТ??; 10 ед, EcoRI; 10 ед °

Pvu; температура 37 С, продолжитель3

3. электрофорез: 0,87 агаровый гель, ТАЭ, 28 В, 15,5 ч

4. перевод на фильтр из нитроцеллюлозы

5. предварительная гибридизация:

30 мл ФДНН, 42 С, 6 ч, 6 . гибридизация: 5 -фрагмент

lxl0 имп в мин/млн pR 18, условия: температура 42Ч:, продолжительность

20 14 ч;

7. промывка: 2 х SSC — 0,17 додецилсульфата натрия при комнатной тем— пературе: погружения 4х10 мин; 1 х х SSC — 0,17 додецилсульфата натрия

25 при 50 C: погружения 2х30 мин

8. выдержка: рентгеновская пленка

XAR-5 80 С, 2 усиливающих экрана, l4 ч, Результаты гибридизации приведе30 ны в табл.3.

Используют бактериофаги РС-l u

RG-2 вместо каждого иэ бактериофагов

HG-3, HG-6 и HG-7. В результате находят, что фрагмент 5 pR 18 гибридизован с фрагментами или фрагментом, содержащимися в одном слое, получаемыми в результате расщепления RG-1 и RG-2, и каждым из энзимов:

40 BamHI, EcoRI, BgIII; HindIII H

BamHI + EcoRI, 5,33 мкг полученной при этом ДНК

HG-3 расщепляют с использованием

80 ед. EcoRI при 37 "С в течение 3 ч.

Продукт расщепления подвергают электрофорезу с использованием IЕ-ного агарового геля с низкой температурой плавления.

Слой с 2,9 т.п.о. выделяют из ага5р рового геля. Часть геля, содержащего слой 2,9 т.п.о., нагревают при

65 С н течение 15 мин. Расщепленный

Есор| фрагмент HG-3, имеющий длину

2,9 т.п.о. (впоследствии обозначае55 мый "НС-3/EcoRI-2 9 т.п.о.-фрагмент) ф ° ° 1 выделяют из расплава геля в результате трехкратного экстрагирования фенолом и трехкратного экстрагирования этанолом с последующим осаждением

45,Описанный выше рестрикционный анализ показывает, что положительными являются 8 клонов из 10. Это значит, 55 что эти 3 клонов содержат фрагмент с 2,9 тыс.п.о.. Из восьми положительных клонов выбирают один клон, обозначая его как Е.coli К-12, штамм IM-83 (рН Ge) (АТСС 39656), 16076 этанолом, содержащим ацетат аммония.

В результате отмеченных вьппе операций получают 637 нг HG-3/EcoRI-2,9 т.п .о . †фрагмен (выход около 30X) .

255 нг полученного согласно описанному выше способу фрагмента связывают с 6,5 нг расщепленного

EcoRI pUC-13 с использованием 2,5 ед.

Т4 — лигазы при 4 С и продолжительности обраоотки 20 ч.

Трансформацию Е.coli К вЂ” 12, штамм

IM-83, осуществляют с использованием полученного согласно описанному выше способу продукта связывания. F..ñîli

К-12, штамм IM-83, культивируют в среде Дурье-Вертани до того момента, пока оптическая плотность бульона культуры не станет равной 0,3 при 550 нм, 50 мл выращенной культу- 20 ры Е,coli К-12, штамм IN-83, собира†. ют, промывают 25 мл 10 MM раствора морфолинопропансульфокислоты (рН 7,0)—

10 мМ хлористого рубидия, и вновь суспендируют в 25 мл раствора 0,1 M 25 морфолинопропансульфокислоты (рН 6,5)—

50 MN хлористого кальция — IО мМ хлористого рубидия. Суспензию охлаждают во льду в течение 30 мин, центрифугируют и вновь переводят в суспен- 30 .зию в смеси 2 мл О,1 M морфолинопропансульфокислоты (рН. 6,5) — 50 мМ хлористого кальция — 10 мМ хлористого рубидия и 30 мкл ДМСО. К 203 мкл суспензии добавляют 10 мкл водного

35 раствора продукта связывания, содержащего 10 нг продукта связывания.

Смесь охлаждают во льду в течение

30 мин, после чего нагревают до 42ОС в течение 60 с. Немедленно вслед за 40 этим к нагретой смеси добавляют 5 мл среды Лурье — Вертани, предварительно нагретой до 37 С, после чего в течение 1 ч осуществляют инкубирование при 37 С. Получаемый при этом культуральный бульон центрифугируют и удаляют верхний слой.После этого добавляют среду Лурье-Бертани к полученному клеточному концентрату и инокулируют на чашку co cperroA 50

Лурье-Бертани, содержащий 30 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл Х-галактозида. Колонии, содержащие Е.coli К вЂ” 12, штамм IM-33 трансформированный плазмидами, содержащими вставки, имеют белый цвет, тогда как колонии,содержащие Е.coli К вЂ” 12, штамм П -ЗЗ,трансформированный только плазмидами,имеют голубой цвет. Полученные колонии

26 оелого цвета вновь инокулируют на чашках со средой Лурье-Бертани,содер. жащей 30 мкг/mr ампициллина и

40 мкг/мл Х-галактазида с целью подтверждения полученного результата.

Из полученных согласно описанному выше способу белых колоний выбирают 10 колоний (бактериальные клоны), которые подвергают отбору с использованием микропрепаративной методики, Каждую колонию культивируют в течение ночи в среде, содержащей 30 мкг/мл ампициллина. Растущие клетки собирают и переводят в суспензию в растворе, содержащем 2 мг/мл лизоцима—

50 мМ глюкозы — 10 мМ ЭДТУ вЂ” 25 мМ трис-HCl — буфера (рН 8,0). Суспензию оставляют при комнатной температуре в течение 5 мин,после чего добавляют к ней 200 мкл 0,2 н. гидрата окиси натрия — 17 додецилсульфата натрия.

После медленного перемешивания суспензию оставляют при комнатной температуре на 2 мин. После этого добавляют 150 мкл 3 М раствора ацетата натрия (рН 5,2), смесь оставляют при

-20ОС в течение 10 мин, после чего центрифугируют в течение 15 мин,выделяя таким образом верхний слой жидкости. 1< указанному верхнему слою добавляют 900 мкл холодного этанола, после чего центрифугируют в течение

10 мин, получая в результате осадок.

Полученный осадок промывают 707.-ным этанолом и сушат, получая в результате ДНК плазмиды. С использованием описанного выше способа получают

10 ДНК плазмид.

Каждую из JIHK плазмид растворяют в растворе 10 мМ Трис-буфера -0,1 мМ

ЭДТУ (рН 8,0), расщепляют Гсо Х и подвергают электрофорезу для рестрикционного анализа. Условия расщепления и проведения электрофореза следующие: расщепление †раств ЛНК плазмид 1:5 часть от полученного вьппе количества; FcoRI: 3 ед., 37 С, 1,5 ч; электрофорез — 17.-ный агаровый гель, 1хТАЭ, 120 В, 2 ч.

27

Те же самые операции в той же последовательности, как и в описанной выше стадии 2, повторяют для получения 1,39 мг ДНК рН ГЕ, за исключени-. ем того, что используют F.coli К-12, 5 штамм ЕИ-83 (рНСЕ), вместо F.. cnli c обработкой с участием рВ 2-7 pR 18.

30 мкг RG-1 расщепляют F..co%I, Иэ получаемой при этом смеси фрагмен- 10 тов выделяют фрагмент, имеющий длину около 3,5 тыс.п.о. с использованием точно такого же способа, что и описанный выше для стадии 9, за исключением того, что используют полученную ,ранее смесь фрагментов и 0,81-ный агаровый гель с низкой температурой плавления. Б результате получают

1,0 мкг расщепленного FcoRI фрагмента PG-1 (3,5 тыс,п .о.). Полученный согласно описанному выше способу расщепленных EcoRI фрагмент РС-1 (3,5 п.о,) связывают с расщепленным EcoRI pUC-13 за исключением того, что используют полученный ранее 25 фрагмент, расщепленный EcoRI (3,5 тыс.по) вместо расщепленного FcoRI фрагмента HG 3 (2,9 тыс.п.о,), Осуществляют трансформирование

E.coli К-12 штамм IY. — 83, отбор бакте- 30 риальных клонов, расщепление клонов и электрофорез за исключением того, что используют полученный согласно описанному вьппе способу продукт связывания. Полученный клон обозначают

Е.coli К-12 штамм 111-83 (р Се) (АТСС

39655) Операции" повторяют для получения 1,70 мг ДНК pRGE, за исключением того, что вместо рВ 2-7 и рР 18 используют F,.coli К-12, штамм II<-83 (pRGE).

Осуществляют рестрикционный энзиметический анализ ДНК рНСЕ, При этом используют следующие опе- „ рации и условия;

1, расщепление ДНК рНСЕ посредством EcoRI 13,6 мкг ДИК pHGE, 64 ед.

EcoRI 37 С, 2 ч;

2, осаждение этанолом: используется осадок;

3. добавление к осадку дистиллированной воды — получение раствора расщепленной EcoRI рНСЕ концентрацией I мкг/мл;

4. расщепление различными рестрик55 ционными феpHeнтами;

1 мкг/мл расщепленной FcoRI pHGE; рестрикционные ферменты! 5 ед. Pvu, 11,5 ед. Pvui I + 10 ед ° RsaI, 10 ед.

RsaI, 4 ед. Mst, 11,3 ед. Aval,9 ед.

PstI, 37 С, 2 ч;

5. электрофорез: 27-ный агаровый гель, 1хТАЗ, 23 В, 14,5 ч;

6. перенос на нитроцеллюлозный фильтр;

7. первая предварительная гибридизация: 30 мл ФДНН, 42 С, б ч;

3. первая гибридизация: 5 — фраг— мент 5х10 имп. в мин/мл рЕ 13 42 С

14 ч

9. промывка: 2 х SSC — 0,1Е р-р додецилсульфата натрия при комнатной температуре — 4 погружения по 10 мин;

1 х SSC — О,!7. р-р додецилсульфата натрия при 50 С вЂ” 2 погружения по

30 мин, 10. вь>держка: рентгеновская пленка

XAR-5, 2 усиливающих экрана, 17,5 ч;

11. вымывание 0,5 ! НаОН вЂ” 1,5 1!

НаС1; погружение мин, 0,5 11 Трисбуфер-2,5 ! 11аС1: погружение 1 мин, ЗхННЦ вЂ” погружение мин;

12. выдержку осуществляют;

l3. .вторая предварительная гибридизация;

14. вторая гибридизация: вставка рН 2-7, 42 С; 16 5 ч;

15. промывка;

l6. выдержка, за исключением того, что время выдержки составляет 19,5 ч;

17. вымывание;

13. выдержка, за исключением того, что время выдержки составляет 20 ч;

19. третья предварительная гибридизация;

20, третья гибридизация: 3 -фраг>

5 мент (4,5х10 мин в мин/мл рР. 13), 42 С, 15÷;

21. промывка;

22. выдержка.

Осуществляют рестрикционный ферментативный анализ ДНК плазмиды

pRGE.

Повторяют те же операции, за исключением того, что используют Е.соl

К-)2, штамм IY-83 (pHGE), и F..coli

К-12, штамм IM-83 (pPGE), вместо

Е.coli К-12, штамм ИС вЂ 10, с рВ 2-7, и Е,coli, штамм ИС-1061 с pR 18 ° Та ким способом получают по 150 мкг

ДНК плазмиды рРСЕ и ДНК плазмиды рНСЕ.

Последовательности оснований в

pPGE u pHGE определяют согласно способу Максам — Гильберта.

1607690

R ТСА GCT ТСТ CGG GCC CTG AGT GAC AAG ССТ СТА GCC САС GTA GTA

Н TCA ТСТ ТСТ CGA ACC CCG AGT GAC AAG ССТ GTA GCC САТ GTT GTA.

R GCA AAC CCG САА GTG GAG GGC CAG СТС CAG TGG CTG AGC CAG CGT

Н GCA ААС ССТ САА GCT GAG GGG CAG СТС CAG TGG CTG ААС CGC CGG

R ОСС ААС GCC CTG CTG CGC AAC GGC ATG AAG СТС ACG GAC ААС CAG

Н GCC ААТ GCC СТС CTG GCC ААТ GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG

R CTG GTG СТС CCG GCC GAC GGG CTG TAC СТС АТС ТАС ТСС CAG GTT

Н CTG GTG GTG ССА ТСА GAG GGC CTG ТАС СТС ATC ТАС ТСС CAG GTC

R СТС ТТС АСС GGT САА GGC TGC CGC ТСС ... ТАС GTG CTC СТС АСТ

Н СТС ТТС РАС GGC CAA GGC TGC ССС ТСС АСС САТ GTG СТС СТС АСС

R САС ACT GTC AGC CGC ТТС GCC GTC ТСС TAC CCG AAC AAG GTC AAC

Н САС АСС АТС AGC CGC АТС GCC GTC ТСС TAC CAG АСС AAG GTC ААС

К СТС СТС ТСТ GCC ATC AAG AGC ССС TGC САС CGG GAG АСС ССС GAG

Н СТС СТС ТСТ GCC АТС AAG AGC ССС TGC CAG AGG GAG АСС ССА GAG

R GAG GCT САС ССС ATG GCC TGG ТАС GAG ССС ATC ТАС СТС GGG GGC

Н . GGG GCT GAG GCC AAG ССС TGG ТАТ GAG ССС АТС ТАТ CTG GGA GGG

R СТС ТТС CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG СТС AGC ACC GAG GTC AAC

Н GTC ТТС CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA СТС AGC GCT GAG АТС ААТ

R GAG ССТ GAG ТАС CTG GAC СТТ GCC GAG ТСС GGG CAG GTC TAC ТТТ

Н CGG ССС GAC ТАТ СТС GAC ТТТ GCC GAG ТСТ GGG CAG GTC ТАС ТТТ

R GGG АТС АТТ GCC CTG

Н GGG ATC АТТ GCC CTG

Последовательность оснований

pR 18 сравнивают с последовательностью оснований РИСЕ, определенной согласно указанному выше способу для выяснения структуры, включая экзон и интрон геля ФНО кролика. Затем последовательность оснований pRGE сравнивают с последовательностью оснований РИСЕ с целью исследования гомоло1 гичности и согласованности последовательности в области границы между интроном и экзоном.

Полученные согласно описанному выше способу последовательности осно1

Б реактор из нержавеющей стали с рабочим объемом 500 мкл и фильтрами из нержавеющей стали с каждой стороны вводят 20 мг полистирольной смолы, с которой посредством сукцинатного связывания связан нуклеозид (2,0 мкИ). Смолу обрабатывают бромистым цинком (1 N) в смеси дихлорметана и изопронанола (85:15) для, удалеваний, кодирующие ФНО человека и ФНО кролика, приведены ниже. В последовательности оснований в верхнем ряду

5 приводится последовательность оснований, кодирующая

t ния диметокситритильных защитных групп, промывают последовательно дииетилформамидом, пиридином и ацетонитрилом, после чего сушат в потоке азота. К высушенной смоле добавляют раствор нуклеотида с диметокситри1 тильными группам (Щ1Т-нуклеотида) (20 мкИ) и 60 мкМ мезитиленсульфонилнитротриазола в 200 мл пиридина..

1607690

1 ) 5 — AATT CATGTCATCTTCTCGAAC CCCGAG TGACAA-3

2) 3 -GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCTCACTGTTCGG-5

3) 5 -GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGC-3

4) 3 -ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5

Реакцию сочетания осуществляют в течение 20 мин при 45 С. Указанный цикл снятия защиты и сочетания повторяют для последовательно взятых нуклеотидов до тех пор, пока олигодеоксинуклеотид желаемого типа не будет

10 мкг плазмиды рНСЕ расщепляют

20 ед. Е.coRI. После проведения электрофореза на 1 7. †к агаровом

20 геле с низкой температурой плавления элюируют фрагмент длиной 2,9 тыс.п.о.

Этот фрагмент вводят во фрагмент

E.coRI на репликативной формы фага

M-13 mp-9, Фаг И-13 тр9 выбран по- 25 стольку, поскольку он особенно хорошо подходит для удержания частей

ДНК. Продукт переводят на Е,coli

IM-103. Полученный продукт обозначают М13 тр9-НСЕ.

Получают одноцепочечную ДНК M-13

-mp9-HGE, Олигодеоксинуклеотид 3 -АСАТСССС

TACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5 полученный согласно описанному на стадии

14 способу, используют в качестве делектора для интрона-3. Делектор для интрона-3 обозначают Е3-4, Делектор ЕЗ-4 имеет последовательность оснований, комплементарную последовательности оснований перед (экэон 3) и после (экзон 4) ннтрона 3, который подлежит делеции. -Делецию интрона 3 осуществляют следующим образом.

ЕЗ-4 (164 нг, 15 пмоль) фосфорилируют с использованием Т4-киназы (!О ед) и АТФ (3 MM) и добавляют к матрице M-13 mp9-HGF. (1,65 мкг, 0,5 пмоль). Реакционную смесь нагревают при 65 С в течение 10 мин, охо 50 лаждают до комнатной температуры в течение 5 мин и наконец охлаждают в смеси воды со льдом, К МАТФ, ЙСТФ, ЙСТФ, йТТФ и АТФ (0,4 мМ) добавляют фрагмент Кленова (5 ед.), Т4-лигазу

55 (10 ед.) в Hin буфере 10 мМ Трис-HClбуфере (рН 7,2), 2мМ хлористого магния и l мИ !б-меркаптоэтанола. Реаксвязан сo смолой. Затем смолу обрабатывают таким образом, чтобы снять с нее олигодеоксинуклеотид, и очищают.

В результате получают следующие оли год ео кс инуклео т иды: ционную смесь (конечный объем 50 мкл) инкубируют в течение 30 мин при 4 С, а затем в течение 30 мин при комнатной температуре. ДНК, полученную при реакции основного олигонуклеотида, используют для трансфекции Г.coli IM †1, Полученные колонии переводят в чашки УТ . Голученные колонии гибридизуют при 55 С в течение 2 ч с меченым Р ЕЗ-4. Для этой стадии

Ъ делектор используют н качестве пробы для идентификации последовательностей ДНК, имеющей соответству|ощую комплементарную последовательность оснований после интроча, подлежащего делеции. Фаг выделяют из тех колоний, которые гибридизованы с делектором.

Полученный при этом фаг помещают в чашку, и негативные колонии переводят в чашки УТ. Клоны оставляют для гибридизации при 55 С в течение о

2 ч с меченым фосфором P ЕЗ-4.При этом получают положительные клоны, а ДНК фага секвенируют для выбора такого фага, в котором интрон 3 полностью делетирован. Фаг такого рода обозначается как р9-НСГА 3-1 °

Репликативную форму mp 9-HGe ДЗ-1 расщепляют посредством F,.coRI.Фрагмент FcoRI выделяют и клонируют в

FcoRI — расщепленный pBR-327,получая плазмиду pHGE 3-1.

Конструирование остальных плазмид осуществляют с использованием плазмиды pHGE 3-! для получения такой плазмиды 3-1, которая была бы способна к прямой экспрессии ФНО в Е.coli с использованием lacHV 5 в качестве промотора, Вначале 10 мкг плазмиды pHGE \3-1 расщепляют 10 ед

AVaI и ЕсоРТ при 37 С в течение 2 и и подвергают электрофорезу на поли33

34

1607690 акриламидном геле (4 мас. ) для вы— деления фрагментов. В результате электроэлюирования из геля выделяют примерно 1 мкг фрагмента. Синтезиру5 ют два олигодеоксинуклеотида а именЪ

t но 5 -AATTCATGGCATCTTCTCGAACC-3! и

5 -TCGGGGTTCGAGAAGATGACATG-3 . Затем

5 -конец каждого из указанных двух

1 олигодеоксинуклеотидов (примерно

I OO пмоль) фосфорилируют с использованием Т4-полинуклеотидной киназы, После окончания реакции реакционную смесь экстрагируют сначала фенолом, а затем хлороформом. Затем полученные 15 описанным выше способом синтетические олигомеры смешивают с 0,5 мкг полученного ранее с использованием 10 ед

14-лигазы в соответствии Aval-FcoRI фрагмента плазмиды pFIGF. 63 †и 20 осаждают этанолом. Укаэанные фрагменты связывают в течении ночи при 4 С с использованием. После окончания реакции реакционную смесь осаждают этанолом, после чего осуществляют элект- 25 рофорез на полиакриламидном геле (4 мас.%) для выделения указанного фрагмента электроэлюированием.

I мкг рОр 95-15 расщепляют FcoRI и экстр-.,гируют сначала фенолом, а за- 30 тем хлороформом, после чего, осаждают этанолом, получая при этом вектор °

0,5 мкг полученного ранее вектора связывают с полученным ранее фрагментом с применением Т4-ДНК-лигазы.

Трансформируют Е.Coli П -101 (АТСС

33876) с использованием полученного ранее вектора, после чего культивируют ее на агаровой среде, содержащей

1 мМ изопропилтиогалактазида (ИПТГ) 40 и 0,004 мас./об . Х-галактазида,получая в результате около 100 белых колоний °

ДНК плазмиды получают из указанных трансформантов и расщепляют ее посредством FcoRI для идентификации тех плазмид, которые содержат соответствующий FcoRI фрагмент. Для исследования направления введения указанные плазмиды расщепляют посредством PvuII u PvuI н подвергают электрофорезу на агаровом геле (1,5 мас. ) для селекций плазмнд, образующих фрагменты длиной примерно 1280 пар оснований и около 2600 пар оснований, 55 что показывает, что направление транскрипции lac — UU-5 промотора находится в соответствии со случаем олигодеоксинуклеотидов, кодирующих ДНК.

Анализ последовательности оснований показывает, что указанные 2 нлазмиды имеют ту же самую последовательность, и ч то l ac-UV-5 промотор, синтезированный олигодеоксинуклеотид и

ДНК надлежащим образом связаны друг с другом. Полученную в результате плазмиду обозначают рЧФНО-lacUV 5-2 (pFiTNF-1acUV 5-2).

Е.coli содержащую рЧфНО-lас UV

5-2, культивируют на обычной питательной среде. Физиологические испытания продукта на ФНΠ†активнос показывают наличие такой же активности, которая достигается в случае плазмиды рЧФНО-lacUV 5-1, содержащей

ФНО-ген кролика при контролировании с использованием lac-промотора.

Пример 3. С использованием плазмиды pHGE и олигодеоксинуклеотидов 1 — 4, полученных с использованием методики, получают рЧФНО-lacUV 5-1 (рНТ HF-lacUU 5-!).

Е.coli, содержащую рЧ !НО-lacUV

5-2, культивируют в обычной питательной среде и индуцируют согласно известным способам. Затем Г.coli культивируют с целью получения клеток Е.coli содержащих физиологически активные вещества, которые используют согласно изобретению. Клетки собирают после центрифугирования и подвергают лизисной обработке при облучении ультразвуком в 1 л 0,04 М Трис-HClбуфера (рН 7,8), получая в результате клеточный экстракт, содержащий физиологически активное вещество. °

Клеточный экстракт обладает цитотоксической активностью 4,5х10 ед/л.

Удельная активность активиого вещества в экстракте составляет 3,0 х х 10 ед/мг протеина.

4.

Затем экстракт подвергают обработке на колонке, наполненной BEAEсефарозой CL-6Â, уравновешенной относительно 0,04 F Трис-НС1-буфером (рН 8,0), и после этого элюируют с применением 0,04 М Трис-НС1-буфера (рН 8,0), Колонку промывают 0,04 М

Трис-НС1-буфером (рН 8,0) и после этого элюируют с применением 0,04 М

Трис-ÍÑ1-буфера (рН 8,0), содержащего 0,1 М хлористого натрия. Активные фракции собирают и концентрируют в результате проведения ультрафильтрации, после чего получают неочищенный раствор, содержащий активное вещество, имеющее удельную активность

1607690

4,0х10 ед/мг протеина. Полученный согласно описанному выше способу неочищенный раствор подвергают обработке на колонке заполненной "Сафа%

5 крилом $-200", уравновешенной относительно 5 мИ фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,15 М хлорис! того натрия, после чего осуществляют гель-фильтрацию с использованием того же буфера. Активные фракции собирают вместе и. концентрируют в результате проведения ультрафильтрации, получая раствор, содержащий физиологически активное вещество, имеющее удельную активность, равную 7,0 х х 10 ед/мг протеина. Аликвоту полу6 ченного согласно описанному выше способу раствора разбавляют 5 MM фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим

0,15 M хлористого натрия, получая раствор физиологически активного вещества, имеющий цитотоксическую активность, равную 120 ед/мл.

Аликвоты полученного согласно опи- 25 санному выше способу раствора добавляют отдельно к альбумину сыворотки человека бычий альбумин, получают образцы раствором, имеющие концентра1 ции альбумина, приведенные в табл.4. ЗО

Для каждого из полученных образцов растворов определяют остаточную активность по отношению к образцам, которые соответственно выдерживают в течение

2, 7 и 30 сут при 4 С. При проведении описанного вьш е испытания в качестве контрольного образца используют раствор активного вещества, в который не вводился альбумин.

Для определения остаточной актив- 40 ности исследуют активность каждого иэ образцов in viva или in vitro„IIpn исследовании ln vitro остаточную активность рассчитывают из опытного значения согласно следующему уравнению:

Остаточная активность (Ж) = -- — х

В х 100 где А — цитотоксическая активность образца после физической обработки или хр нения;

 — :итотоксическая активность образца до физической обработки или хранения.

При исследовании in vivo каждый образец раствора концентрируют,достигая степени концентрации 20 по сравнению с исходным раствором. Затем но 0,5 мл каждого чэ сконцентрированных подобным способом растворов вводят через хвостовую вену каждой из мышей (B группах по 5 животных), зараженных опухолями. Противоопухолевую активность исследуют спустя 24 ч в соответствии с приведенными ниже критериями °

Пример 4. Для каждого из растворов определяют остаточную активность в отношении: образцов, прошедших соответственно однократный или трехкратный цикл замораживания до

-70 С и таяния, и образцов, подвергшихся замораживанию до -70 С, лиофилиэации и хранению при комнатной температуре в течение 7 сут. При проведении описанного выше испытания в качестве контрольного обраэца используют раствор активного вещества, не содержащий альбумин. Что касается лиофилизированной пробы, то ее растворяют в стерильной дистиллированной воде, после чего испытывают образец на цитотоксическую активность. Испы— тывают in ч1чо или in vitro остаточную активность каждого образца.

Пример 5. К аликвотам добавляют ФНО человека по отдельности в различных концентрациях вещества, которые являются хорошо известными стабилиэируюшими агентами для растворов обычных физиологически активных веществ, в ч ас тно с ти различные аминокислоты, соли металлов и хелатообраэующие агенты. Каждый иэ полученных при этом растворов хранят при 4 С в течение 7 сут, после чего испытывают на наличие противоопухолевой активности согласно методу испытаний in

viva, Остаточную активность определяют расчетным методом, описанным выше.

Полученные результаты сведены в табл. 5.

Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я

Способ стабилизации рекомбинантного фактора некроза опухоли, включающий добавление к водному раствору, содержащему фактор некро,a опухо,ли, с цитотоксической активностью по отношению к L-М клеткам, равной

10 — 10 ед/мл, вызывающему геморра— 2 9 гический некроэ трансплантированной

)607690

Ser- Sе r-Sе r-Агд- Thr-P ro- Se r-Asð-Ly s-Pro-V à l-Al aHis-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gln-LeuGln-Trp-Leu-Asn-Arg-Arg-Аlа-Asn-Ala-Ley-Leu-AlaAsn-G1y-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Ley-Val-ValPro-Ser-Glu-Gly-Leu-Tyr-Leu-The-Tyr-Ser-Gln-ЧаlLeu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro †S-Thr-His-ValLeu-Leu-Thr-His-Thr-Ile-Ser-Arg-Ile-Ala-Va1-БегТуг-Gln-П г).уз-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-LysSer-Pro-Cys-G1п-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-G1n-Alа-G1u-Аlа.Lys-Pro-Irp-Tyr-Glu-Pro-Пе-Tyr-Leu-Gly-Gly-VàlPhe-Gln-Leu-Alu-Lys-Иу-Asp-Arg-Leu-Ser-Ala-Glu-IleAsn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser-GlyGln-Val-Tyr-Phe-Gly-Ile-Ile-Ala-LeuTCA ТСТ ТСТ CGA АСС CCG AGT GAC AAG ССТ GTA ССС САТ GTT GTA .

GCA AAC ССТ CAA GCT GAG GGG CAG СТС CAG TGG CTG ААС CGC CGG

GCC AAT GCC СТС CTG GCC ААТ GGC GTG GAG CTG AGA GAT ААС CAG

CTG GTG GTG CCA ТСА GAG GGC CTG ТАС CTC ATC ТАС ТСС CAG GTC

CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC ССС TCC АСС САТ GTG СТС СТС АСС с

САС ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC ТСС ТАС CAG АСС AAG GTC AAC в

СТС СТС ТСТ GCC АТС AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG АСС ССА GAG

GGG GCT GAG GCC AAG ССС TGG TAT GAG ССС ATC ТАТ CTG GGA GGG

GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA СТС AGC GCT GAG АТС ААТ

CGG ССС GAC TAT СТС GAC ТТТ GCC GAG TCT GGG CAG GTC ТАС ТТТ

GGG ATC ATT GCC СТС человеческого сывороточного альбу- водного раствора. мина в количестве 10 — 50 мг на 1 мл

IlethA саркомы в мьппках BALB/С,кото. рый кодируется pHT)JF-lacUV 5-2 плазI,и нуклеотидной последовательностью мидой и характеризуется следующей последов а тель но стью аминокислот:

39,1607690

Таблица 1

Число ренатурирован пых пар основ а1!лазмида

Оп тич ec-.

Цитотоксическая аккая плотность

06О0 тивность против Lклеток,ед/мл ний рВ 2-2 рВ 2-3 рВ 2-7

pR 9

pR 12

pR 18

pR 25

pBR322

Таблица 2

Лоля выз—

Введенное инъекцией

Количество мышей,использованных для испы тания

Оценка активности образцов через 1 день количество кроличье—

ro ФНО, выработанного E. со1i, ед./мьппь доров< вших

ЧЕРЕ.1

20 дней

+++

5/5

О О

n/5

5 О 0

Г а б -.1.! « .1 3

Клон (б«< (Нрос<л HR I 3) териофаг) < рачмер гибрицнаироваиного

< фрагмента, т,n.à, Знн«м! Конел 5 Ko«e« 3

Н а<в н 1

Нан<Н1

EcoR1

EcoRt

HindIII

EcoRI

HI»aII1

0,о

0,9

0,9

PmII

П р и м е ч а н и е. Символ " е — обовиачает гибридиааиию того ве самого фрагмента.

2х 10

Контроль (физиоло— гический солевой раствор) нс-3

Н(-6

Н1-7 нс-3 нс-6 нс-7

Н<1-3 нс-6 нс-7 нг;3

HG-6

НС-7

HG-3

HG-6

НС-7 нс-3

HG-6

HG-7

1400 1,369

800 1,605

1060 1,364

1550 1,618

1400 1,458 !

850 1,438

1350 1,514

О 1,677

6,7

1l,2

9,2

2,9

2,9

2,9

2,9

2,9

2,9

2,9

2,9

2,9

9,7 ч, I

9,7

2,2

1,9

2,2

«10

«.! О

«10

«l 0

«l0

«10

42

1607б90

Таблнца4

Стабиливи-, Концентрукчаий рация агент мг/кг

Пример I

Пример 2

Заморахивание !Хранение при комнат(-70 С) и от- ной температуре таиванне . (лиофнэнлированный

in vitro 1продукт) ° cyr повторений

in vitro in vivo

Хр ам ение при 4 аС (раствор)

in vitro сут

Хранение при 4 С (раствор) Ф

in vivo сут

2 7 нет (контроль)

HSA

100 45

l 00 99

+29-2

+++3

++1

+++3, ++2

+++4, ++1

40 о5

14 2 ++3, ++3

95 91 ++3) ++2

+4 в

+++3i+++2

l4

0,1

100 98 96 90 ++3,++2

100 97 98 94 ++3,++2

+++4, +1

+++3,++2

95 10l

95 97

HSA

100

ИВА

Таблица 5

Концентра- Остаточная

Стабилизирующий агент

ЦИЯ активность, Е хранение при4С в течение

7 сут

Нет (контрольный)

HSA

Глицин

1 — Лизин

L-Аргинин

L-Глютаминовая кислота

Хлористый

K 8JIbIJHH

Хлористый магний

ЭДТА

l4

96

13

1 мг/мл

0,1 М

0,1 М

0,1 М

0,1 И

1 мМ

1 ММ

1 МИ

14

18

Ф

Составитель Н,Кузенкова

Техред Л.Олийнык Корректор А.Обручар

Редактор Н. Киштулинец

Заказ 834 Тираж 379 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г.ужгород, ул. Гагарина,101

П р н и е ч а í s я. Цифры в колонках, отиосяаихся к испытаниям Тп ч сго, представляют собой остаточную активность согласно денному вьше определению. Цифры в колонкак, относяииеся к испытаниям in vivo представляют собой число ьышей