Питательная среда для культивирования legionella pneumophila

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования Legionella pneumophila , а также для специфической диагностики болезни легионеров и выделения возбудителя из внешней среды. Цель изобретения - повышение ростовых cвойств среды. Исследуемую культуру разводят, наносят соответствующее разведение на поверхность среды следующего состава, г/л: серно-кислотный гидролизат рыбной муки 8,0-11,0; L - цистеин 0,2-0,4; источник железа 4,0-11,0 (гемоглобин 4,0-7,0 г/л или ферментативный гидролизат альбумина черного, или альбумин черный 8,0-11,0 г/л); калий фосфорнокислый однозамещенный 1,2-1,3; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,8-3,9; агар 10,0-15,0; дистиллированная вода 1 л. Среда обеспечивает хороший рост легионелл, более чувствительна (показатель прорастания 50-80%). 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования L. pneumophila, а также для специфической диагностики болезни легионеров и выделения возбудителя из внешней среды. Целью изобретения является повышение ростовых свойств среды. Ферментативный гидролизат черного альбумина готовят следующим способом. 50 г альбумина черного и 5 г протосубтилина Г10Х заливают 500 мл дистиллированной воды и оставляют для набухания на 40-60 мни при комнатной температуре при постоянном перемешивании. К 500 мл дистиллированной воды добавляют 1,75 мл 20%-ного раствора NaOH и при перемешивании вносят в суспензию альбумина черного. Смесь нагревают до 35-40^оС и добавляют 2,5-3,0 мл 20% -ного раствора NaOH. Гидролиз ведут при 50^оС, рН 8,3-8,5 в течение 40 мин с постоянной корректировкой рН. По окончании гидролиза гидролизат фильтруют и сушат на распылительной сушилке при температуре воздуха на входе в сушильную камеру 135-145^оС, на выходе 80-82^оС. 1% -ный водный раствор сухого гидролизата имеет следующие характеристики. Массовая доля азота ами- ногруппы аминокислот и низших пептидов, % 0,025-0,040 Массовая доля азота общего, % 0,12-0,15 Показатель концентрации водородных ионов 7,8-8,2 Питательную среду готовят и используют следующим образом. П р и м е р 1. 8,0 г сернокислотного гидролизата рыбной кормовой муки, 1,2 г калия фосфорнокислого одднозамещенного, 3,8 г калия фосфорнокислого двузамещенного трехводного, 10,0 г агара суспендируют в 690 мл дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 121^оС в течение 20 мин. 4,0 г гемоглобина суспендируют в 300 мл дистиллированной воды и стерилизуют в тех же условиях. Водный раствор L-цистеина (0,2 г в 10 мл) стерилизуют отдельно при 112^оС в течение 30 мин. Все компоненты среды стерильно смешивают при 50-60^оС, тщательно перемешиваю и разливают в стерильные чашки Петри. рН среды 6,8-7,0. Испытания питательной среды проводят следующим образом. В качестве посевного материала используют 24-часовую культуру легионелл, выращенных на угольно-дрожжевом агаре (УДА). Суспензию культуры наносят на поверхность среды по 0,1 мл соответствующего разведения (1000 и 100 м.кл. в 1 мл). В качестве контроля используют среду - угольно-дрожжевой агар. Посевы инкубируют при 37^оС. Учет результатов проводят через 72 и 120 ч. При этом определяют чувствительность среды по максимальному разведению культуры, при котором на всех засеянных чашках обнаруживается рост, и показатель прорастания (отношение числа выросших колоний к расчетному числу микробных клеток в посевной дозе), морфологические и культуральные свойства выросших клеток. Результаты испытаний представлены в таблице. П р и м е р 2. Готовят среду, как описано выше, используя компоненты в следующих концентрациях, г/л: сернокислотный гидролизат рыбной кормовой муки 7,5; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,25, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,85; гемоглобин 5,5; L-цистеин 0,3; агар 12,5; дистиллированная вода 1 л. Испытания среды проводят как описано в примере 1. П р и м е р 3. Готовят среду как описано в примере 1 но компоненты берут в следующих соотношениях, г/л: сернокислотный гидролизат рыбной кормовой муки 11,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,3; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,9; гемоглобин 7,0; L-цистеин 0,4; агар 15,0; дистиллированная вода 1 л. Испытания среды проводят по примеру 1. П р и м е р 4. 4,0 г сернокислотного гидролизата рыбной кормовой муки, 1,2 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 3,8 г калия фосфорнокислого двузамещенного трехводного, 10,0 г агара суспендируют в 690 мл дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 121^оС в течение 20 мин. Суспензию альбумина черного (8 г в 300 мл) стерилизуют в тех же условиях. Водный раствор L-цистеина (0,2 г/10 мл) стерилизуют автоклавированием при 112^оС в течение 30 мин. Компоненты среды стерильно смешивают и разливают в чашки Петри. Среду испытывают, как описано в примере 1. П р и м е р 5. Готовят среду, как описано в примере 4, но компоненты используют в следующих соотношениях, г/л: сернокислотный гидролизат рыбной кормовой муки 7,5; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,25; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,85; альбумин черный 9,5; L-цистеин 0,3; агар 12,5; дистиллированная вода 1 л. Среду испытывают как описано в примере 1. П р и м е р 6. Готовят среду как описано в примере 4, используя ингредиенты в следующих концентрациях, г/л: сернокислотный гидролизат рыбной кормовой муки 11,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,3; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,9; альбумин черный 11,0; L-цистеин 0,4; агар 15,0; дистиллированная вода 1 л. Испытания питательной среды проводят по примеру 1. П р и м е р 7. 4,0 г сернокислотного гидролизата рыбной кормовой муки, 8,0 г ферментативного гидролизата альбумина черного 1,2 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 3,8 г калия фосфорнокислого двузамещенного трехводного, 10,0 г агара суспендируют в 990 мл дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 121^оС в течение 20 мин. Водный раствор L-цистеина (0,2 г в 10 мл) стерилизуют при 112^оС в течение 30 мин, стерильно добавляют к готовой среде и разливают в стерильные чашки Петри. Питательную среду испытывают, как описано в примере 1. П р и м е р 8. Готовят среду, как описано в примере 7, используя компоненты в следующих концентрациях, г/л: сернокислотный гидролизат рыбной кормовой муки 7,5; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,25; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,85; ферментативный гидролизат альбумина черного 9,5; L-цистеин 0,3; агар 12,5; дистиллированная вода 1 л. Испытания проводят по примеру 1. П р и м е р 9. Готовят среду, как описано в примере 7, но берут компоненты в следующих концентрациях, г/л: сернокислотный гидролизат рыбной кормовой муки 11,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,3; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,9; ферментативный гидролизат альбумина черного 11,0; агар 15,0; дистиллированная вода 1 л, L-цистеин 0,4 л. Питательную среду испытывают как описано в примере 1, результаты испытаний приведены в таблице. В таблице представлены средние данные 25 опытов (для каждого варианта отдельно). Как видно из приведенных данных, сконструированная питательная среда превосходит по ростовым свойствам среду-прототип. При одинаковой посевной дозе на ней вырастает почти вдвое больше колоний, которые по размеру крупнее колоний на контрольной среде. Среда более чувствительна, чем УДА, и позволяет выделит из посевного материала вдвое больше микробных клеток (ср. : показатель прорастания на предлагаемой среде 50-80%, а на среде-прототипе 20-45%). Испытание предлагаемой питательной среды позволит улучшить бактериологическую диагностику легионеллеза, увеличить выход биомассы L. pneumoрhila за счет повышения ростовых свойств питательной среды, увеличить частоту выделения возбудителя из внешней среды за счет повышения чувствительности среды вдвое (повышение показателя прорастания до 50-80%).

Формула изобретения

1. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ LEGIONELLA PNEUMOPHILA, содержащая источник азота, источник железа, источник фосфора, L - цистеин, агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения ростовых свойств среды, она в качестве источника азота содержит сернокислотный гидролизат рыбной муки, в качестве источника фосфора - калий фосфорнокислый однозамещенный и калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный при следующем количественном соотношении компонентов, г/л: Сернокислотный гидролизат рыбной муки 8,0 - 11,0 L - Цистеин 0,2 - 0,4 Источник железа 4,0 - 11,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,2 - 1,3
Калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,8 - 3,9
Агар 10,0 - 15,0
Дистиллированная вода 1 л
2. Среда по п.1, отличающаяся тем, что в качестве источника железа она содержит гемоглобин в концентрации 4,0 - 7,0 г/л или ферментативный гидролизат альбумина черного, или альбумин черный в концентрации 8,0 - 11,0 г/л воды.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 21.01.2006

Извещение опубликовано: 20.03.2007        БИ: 08/2007

---