Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2

 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и технологии получения человеческого лейкоцитарного интерферона. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Человеческий лейкоцитарный интерферон, синтезированный альфа-2 рекомбинантными бактериями Pseudomonas species получают глубинным культивированием в присутствии стрептомицина и тетрациклина в количестве 50 150 и 30 50 мг на 1 л среды соответственно, причем культивирование осуществляют при 30 - 30,5°С, pH 7 7,1 в среде следующего состава, г/л: гидролизат казеина 120 мл/л, гидролизат пекарских дрожжей 5,0, D-глюкоза 10,0 сернокислый аммоний 3,0, фосфорнокислый двузамещенный трехводный калий 1,5, фосфорнокислый однозамещенный калий 0,6, хлористый натрий 0,5, сернокислый семиводный магний 0,25, хлористый кальций 0,011, дистиллированная вода остальное. Аэрация осуществляется из расчета: в начале роста до 40% от насыщения, при достижении 2,5 3 опт. ед. 50% от насыщения, при достижения 4,5 5 опт. ед. 60% от насыщения, при достижении 6,5 7 оптических единиц 70% от насыщения, а процесс культивирования прекращают через 1 ч после достижения максимальной скорости роста. 1 ил. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и к технологии получения человеческого лейкоцитарного интерферона. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Способ осуществляют следующим образом. Pseudomonas species путем глубинного культивирования в присутствии стрептомицина и тетрациклина в количестве 50-150 и 30-50 мг на 1 л среды соответственно выращивают в среде следующего состава, г/л: Гидролизат казеина 120 Гидролизат пекарс- ких дрожжей 5,0 D-глюкоза 10,0 Сернокислый ам- моний 3,0 Фосфорнокислый двузамещенный трехводный калий 1,5 Фосфорнокислый однозамещенный калий 0,6 Хлористый натрий 0,5 Сернокислый семи- водный магний 0,25 Хлористый кальций 0,011 Дистиллированная вода Остальное Температуру выдерживают 30-30,5^оС, рН 7,0-7,1 рО₂ измеряют по динамике роста: после засева рО₂ поддерживают 40% от насыщения, при достижении 2,5-3 опт. ед. 50% при 4,5-5 опт.ед. 60% при 6,5-7 опт.ед. 70% от насыщения, определяют скорость роста и завершают процесс спустя 1 ч после достижения максимальной скорости роста бактерий. Накопление рекомбинантного интерферона альфа-2 в клетках совпадает с увеличением скорости роста бактерий и накоплением биомассы, т.е. с увеличением оптической плотности в экспонентной фазе роста. При быстром росте клетке приходится расходовать большую часть всей выработанной энергии (до 90%) на биосинтез белков. Так как штамм относится к облигатно аэробным хемоорганогетеротрофам, в ходе ферментации в связи с метаболистическими процессами потребность к кислороду увеличивается, т.е. желательна обильная аэрация. Лимитация по рО₂ снижает скорость роста, а также выход продукта. Слишком высокая аэрация после засева (70% ) создает нежелательный кислородный шок, так как условия аэрации в инокулянтных колбах и в ферментере резко отличаются. Слишком низкая аэрация после засева (5-10%) продлевает лаг-фазу, т.е. лимитирует рост клеток и неблагоприятно влияет на выход продукта. Характер аэрации был определен экспериментально. Однако, невзирая на теоретические соображения, проводили экспериментальный поиск вида аэрации. Наиболее характерные результаты приведены в табл.1. В табл.2 показаны результаты ферментации при разных условиях аэрации. В ферментациях (варианты 1-4) поддерживали уровень аэрации соответственно 5, 15, 40 и 70% от насыщения. Полученные результаты по биомассе Х и продукту INF приведены в табл.1. Пятый вариант соответствует предлагаемому способу. Кроме повышения выхода продукта сокращается и время ферментации. В ходе ферментации определяли скорость роста бактерий и зависимость между скоростью роста и биосинтезом продукта. Экспериментально доказано, что удобно оценивать уровень биосинтеза и определять фазу максимального накопления продукта, т.е. точку завершения процесса, по скорости роста бактерий. Скорость роста определяют следующим образом. Информация об оптической плотности среды поступает на электронную вычислительную машину IBM/PC. Посредством метода сглаживающих кубических сплайнов производят сглаживание (фильтрацию) поступающих данных с точностью 0,2 отн.ед. Скорость роста бактерий (V) определяют из выражения
V_(k)= где Х_(к), Х_(к-1) фильтрированные сигналы в момент времени t_(к) и t_(к-1). Полученное значение скорости роста бактерий V_(к) сравнивают с предыдущим значением V_(к-1). Спустя 1 ч после удовлетворения условия V_(к) V_(к-1) ≅0 процесс биосинтеза завершают. По предлагаемому способу было проведено четыре ферментации. Полученные результаты были обработаны статистически и сравнены с экспериментами, проведенными по предлагаемому способу. Результаты обработки экспериментальных данных, приведенные в табл.2, показывают, что предлагаемый способ биосинтеза альфа-2 интерферона рекомбинантными бактериями P.species позволяет повысить выход продукта по сравнению с известным способом в 5 раз, а по биомассе на 95%
На чертеже приведены экспериментальные данные. По чертежу видно, что максимальное накопление рекомбинантного интерферона альфа-2 в клетках продуцента достигается именно спустя определенный промежуток времени, а именно 1 ч, после достижения максимальной скорости роста. Что же касается точного значения температуры 30-30,5^оС и рН 7-7,1, то эти параметры непосредственно влияют на продолжительность "определенного промежутка времени". Этот параметр также будет влиять на изменение состава среды. П р и м е р. Приготавливают 10 л питательной среды для ферментера Biostat E фирмы "Braun Helsungen" (ФРГ) емкостью 13,7 л с рабочим объемом 10 л следующего состава, г/л:
Гидролизат казеина, мл/л 120
Гидролизат пекарс- ких дрожжей 5
Фосфорнокислый
двузамещенный трех- водный калий 1,5
Фосфорнокислый
однозамещенный калий 0,6
Сернокислый ам- моний 3 Хлористый натрий 0,5
Сернокислый семи- водный магний 0,25 Хлористый кальций 0,011 Тетрациклин 0,05 Стрептомицин 0,15
1 л этой среды разливают в 4х250 качалочные колбы и засевают по 1 мл жидкозаконсервированной культуры Р.species. Колбы помещают на 20±2 ч в термостатирующие качалки при 30±0,5^оС. Полученным инокулятом засевают ферментер. К ферментеру подключают бутыли с 10%-ным раствором силиконового пеногасителя, 40%-ным раствором гидроокиси натрия и 35%-ным раствором фосфорной кислоты. Ферментацию проводят при 30^оС, рН среды поддерживают автоматически на уровне 7, пеногашение на уровне датчика. Каждые 30 мин берут пробы для измерения оптической плотности, определяя скорости роста, рО₂ изменяют по динамике роста: после засева рО₂ поддерживают 40% от насыщения, при достижении 2,5-3 опт.ед. 50% при 4,5-5 опт.ед. 60% при 6,5-7 опт.ед. 70% от насыщения. Спустя 1 ч после достижения максимальной скорости роста процесс биосинтеза завершают. Таким образом, предлагаемый способ биосинтеза альфа-2 интерферона рекомбинантными бактериями Pseudomonas species позволяет повысить выход интерферона в 5 раз по сравнению с известным способом.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2, предусматривающий глубинное культивирование рекомбинантных бактерий Pseudomonas species V6-84, несущих плазмиду pV63 в питательной среде в условиях аэрации в присутствии стрептомицина и тетрациклина в количестве 50-150 и 30-50 мг на 1 л среды соответственно, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода интерферона, культивирование осуществляют на питательной среде следующего состава, г/л:
Гидролизат пекарских дрожжей 5,0
D-Глюкоза 10,0
Сернокислый аммоний 3,0
Фосфорнокислый двузамещенный трехводный калий 1,5
Фосфорнокислый однозамещенный калий 0,6
Хлористый натрий 0,5
Сернокислый семиводный магний 0,25
Хлористый кальций 0,011
Гидролизат казеина, мл/л 120
Дистиллированная вода Остальное
аэрацию осуществляют из расчета: в начале роста до 40% от насыщения, по достижении 2,5-3 опт.ед. 50% от насыщения, по достижении 6,5-7 опт.ед. 70% от насыщения, а процесс культивирования прекращают через 1 ч после достижения максимальной скорости роста. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что температуру поддерживают 30 ±0,5^oС, рН 7,0 ± 0,1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2004

(73) Новое наименование патентообладателя:
ЗАО "Сикор Биотех" (LT)

Извещение опубликовано: 20.04.2004        

---