Способ получения носителя для иммунодиагностики

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к способам получения носителя для иммунодисперсионных диагностикумов. Целью изобретения является повышение устойчивости суспензии носителя и уменьшение расхода иммуноглобулинов . Для этого проводят полимеризацию акролеина в водно-щелочной среде при оН 8-;2 в присутствии 0,001-0,1 мас.% водорастворимого красителя. Полученные окрашенные полиакролеинсвые частицы подвергают радикальной полимеризации в присутствии 2-5% от массы акролеина пероксидных радикальных инициаторов, затем обрабатывают белками при соотношении 1:

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (н)5 G 01 И 33/543

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4652163/13 (22) 24.02.89 (46) 15.01,91, Бюл. KL 2 (71) Институт биоорганической химии им. M.M.Øåìÿêèíà (72) Е.П.Ерохин, Ю.В,Лукин, В.П.Зубов и Д.Н,Авдеев (53) 616.07(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

hL 1227006, кл. 6 01 N 33/544, 1984.

Выложенная заявка Японии М 6324163, кл. 6 01 М 33/545, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЯДЛЯ

ИММУНОДИАГНОСТИКИ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения носителя для иммунодисперсионных диагностикумов. Целью изобретения являИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения окрашенных полиакролеиновьгх латексов, которые могут быть использованы в качестве носителей для создания иммунодисперсианных диагностикумов.

Цель изобретения — повышение устойчивости суспензии носителя и уменьшение расхода иммуноглобулинав.

П р и м е.р 1, В термостатированную колбу, снабженную механической мешалкой и вводом для инертного газа, помещают

3 мл свежеперегнанного акролеина, 70 мл дистиллированной воды с растворенными в ней 0,025 г пиронина (0,33 мас.%) и постепенно добавляют 3 мл 0,2 н. КОН до рН 8,0.

Смесь перемешивают в течение 2,5 ч при комнатной температуре., затем температуру повышают до 60 С, продувают слабым током аргона в течение 20 мин, добавляют

„„5U 162ОуЗу А1 ется повышение устойчивости суспензии носителя и уменьшение расхода иммуноглабулинов. Для этого проводят. полимеризэцию акролеина в водно-щелочной среде при рН 8 — 2 в присутствии 0,001 — 0,1 мас.0/, водорастворимого красителя. Полученные окрашенные полиакролеинсвые частицы подвергают радикальной полимеризэции в присутствии 2 — 5% от массы акралеина пероксидных радикальных инициаторов, затем обрабатывают белками при соотношении 1: (0,3 — 1,0). В результате получают устойчивую в малых разведениях сывороток окрашенную суспензию носителя, который после сенсибилиэации у -глабулинами человека может использоваться для диагностики в, реакции суспензионной агломерации или

ИФА. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

0,12 г персульфата калия (5%) и выдерживают при 50 С в течение 3 ч. Получают окрашенную в ярко-розовый цвет суспензию палиакролеина со средним диаметром частиц 1,5 мкм и коэффициентом полидисперсности К = 1,08. Полученную суспензию трижды промывают дистиллированной водой и отделяют от непрореагировавших реагентов центрифугированием при

3000 об/мин в течение 5 мин. Отмытый осадок редиспергируют в дистиллированной воде до 5%-ной концентрации. 4 мл полученной суспензии осаждают центрифугираванием, Осадок суспендируют в 4 мл 0,15Ì фосфатно-солевого буфера (ФСБ), рН 6,5, добавляют равный обьем 2,5%-ного водного раствора желатина и выдерживают при комнатной температуре в течение 18 ч, Полученную суспензию носителя трижды промывают дистиллированной водой для удаления несвязавшегося желатина на центрифуге и лиофильно высушиваьот, Пример 2. В колбу, снабженную механической мешалкой, вводом дл я инертного газа и помещенную в термастат, наливают 2,6 мл свежеперегнанного акролеина, 70 мл дистиллированной воды с растворенными в ней 0,0008 r пиронина (0,001%) и постенпенно добавляют 6 мл 0,2 í.KOH до рН 12. Перемешивают 4 ч при 20 С, затем температуру смеси повышают до 60 С, продувают аргоном в теченле 20 мин, добавляют 0,05 г (2 ) персульфата калия и перемешивают в течение 3 ч при 60 С. Получают окрашенную в розовый цвет суспензию полиакролеиновых частиц со средним диаметром 0,4 мкм и К= 1,05. 10 мл отмытой игьолученной аналогично примеру 1 5%-ной полиакролеиновой суспензии осаждают центрифугированием, осадок суспендируьат в 0,2 М ФСБ, рН 6,5, добавляют равный объем 5%-ного водного раствора желатина и выдерживают при комнатной температуре в течение 12 ч. Далее обработку проводят аналогично примеру 1.

Пример 3. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, s реакцию берут следующие количества компонентов: акролеина 5 мл; пиронина 0,9 r (0,1%); дистиллированной воды 68 мл; 0,2 н.КОН 6 мл; персульфата калия 0,2 r. Получают полиакролеиновую суспензию ярко-розового цвета со средним диаметром частиц 1,8 мкм и

К = 1,06. Далее 4 мл отмытой 5% ной суспензии осаждают центрифугированием, Осадок суспендируют в 4 мл 0,1 M карбонатного буфера, рН 7,6; добавляют 2 мл 3 -ного

Водного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА). Полученную смесь выдерживают при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 10 ч.

Далее процесс ведут аналогично примеру 1.

Пример 4. B термостатированую колбу помещают 3 мл акролеина, 70 мл дистиллированной воды с растворенными в ней 0,3 r (0,0035 мас. ) красителя малахитового зеленого и постепенно добавляют5 мл 0,2 н.КОН до рН 11. Перемешивают 3 ч при 30 С, затем температуру смеси повышают до 70 С, продувают агроном В течение 20 мин и добавляют 0,075 r динитрила азобисизомасляной кислоты в 1,5 мл эталона (3%) и перемешивают при этой температуре 2,5 ч. Получают окрашеннуьо в зеленый цвет поллакролеиновую суспензию со средним диаметром ча стиц 1,2 мкм и К = 1,08. Отмытый центрифугированием осадок, полученный из 4 мл 5%-ной суспензии аналогично описанном в примере 1, суспендирук>т В 4 wA

0,1 ьл карбонатного буфеоа, рН 7,4„и добав5

1 .">

2ь., 30

3140 ляют к нему 4 мл 1%-ного раствора овальбумина, Смесь выдерживают при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 14 ч. Далее процесс ведут аналогично примеру 1, Пример 5. В термостатированную колбу помещают 3 мл акролеина, 70 мл дистиллированной воды, содержащей 0,006 г красителя (0,00" мас.%) генцлана фиолетового, и добавляьот 6 мл 0,2 н.КОН, Перемешивают 2,5 ч при 35 С, затем температуру смеси повышают до 85 С, продувают аргоном 20 мин и добавляют 0,10 r пероксида бензоила (4%) в 2,5 мл этанола и продолжают перемешивание при 85 С в течение 2 ч. По— лучают окрашенную в синий цвет полиакролеи новую суспензлю со средним диаметром частиц 1,45 мкм л К = 1,07.4 мл промытой

5%-ной суспензии осаждают центрифугированием. Осадок суспендируют в 5 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,2, и добавляют 5 мл

1,5%-ного водного раствора казеина. Смесь выдерживают при комнатной температуре и перемешивании в течение 1? ч. Далее процесс ведут аналогично примеру 1.

Пример 6, Получение сенсибилизированного носителя. а) Активирование носителя.

50 мг носителя, полученного по примеру 1, суспендируют в 1 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем 0,1%-ного водного раствора танина, выдерживают 30 мин при 400С v, двукратно отмывают дистиллированной Водой. б) Сенсибилизация, Активированный носитель суспендируют в 1 мл 0,15 У ФСБ, рН 6,5, до 5 -ной концентрации. К полученной суспензии добавляют 4 мл физиологического раствора поваренной соли (ФР), рН 7,2, содержащего

0,25 мг у -глобулинов человека. Смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. периодически встряхивая, СенсибилизироВанную суспензию носителя центрифугируют, дважды промывают 0,1М ФСБ, рН 7,2, сусгьендируют в 20 мл ФР, рН 7,2, и применяьот для постановки реакции суспензионной агломерации (РСА), Пример ы 7-10. а) Активирование носителей.

По 50 г носителя, полученных по примерам 2 — 5, суспендируют в 1 мл 0,2 М карбонатного буфера, рН 8,5, добавляют равный объем 0,1 j -ного водного раствора эпихлоргиДоина. Смесь ВыДерживают при 37 С В течениеЗО мин, дважды промываютдистиллированной Водой и суспендируют В 1 мл 0,1 М карбонатного буфера, рН 8,5.

1620939 б) Сенсибилиэация.

К полученной суспенэии дсбавля ют 4 мл Ф Р, рН 7,4, содержащего О,З мг у-глобулина человека, выдерживают 1,5 ч при 37 С при постоянном перемешивании. Сенсибилиэированную суспенэию центрифугируют и промывают аналогично описанному В примере 6.

Пример 11. Постановка РСА, РСА проводят для onp=- ze a u ревматоидного фактора Pf аналогично реакции непрямой гемагглютиэации в микропланшетах с U-образными лунками. Для этого в лунках микропланшета готовят ряд последовательных двукратных разведений (по

0,05 мл) Rf-положительной и нормальной (контрольной) человеческой сывороток. Затем в каждую лунку вносят по одной капле . 0,2;ь-HGA суспенэии сенсибилиэированного носителя, полученного согласно примеру б.

Планшет встряхивают и оставляют в покое при комнатной температуре. Результаты

РСА учитывают через 1,5 — 2 ч. При положительной реакции суспензия сенсибилиэированного носителя после оседания равномерно покрывает дно лунки в виде агглютината нежно-розового цвета. При отрицательной реакции суспензия оседает на дно лунки в виде колечка или компактной

"пуговки" ярко-розового цвета с четко очерченными краями. Результаты анализа представлены в.таблице.

Результаты сравнительного анализа в

РСА Rf-позитивной сыворотки и нормальной (контрольной) сыворотки человека с по- мощью сенсибилизированных. у-глобулинами человека носителей, полученных по предлагаемому и известному способам, представлены s таблице.

Как видно иэ таблицы, сенсибилизировакный носитель, полученный по известному способу, дает ложно-положительную реакцию в малых разведениях нормальной (отрицательной) сыворотки, Это свидетельствует о неустойчивости суспензии носителя в сыворотках при разведении последних в 2-16 раз, В то же время полученный сенсибилизированный носитель стабилен в малых разведениях сыворотки.

Пример 12. Получение носителя, сенсибилизированного белковым антигеном.

Активирование носителя, полученного

5 по примеру 2, проводят аналогично примеру 7. К актмвированной суспензии носителя добавляют 4 мл ФР, рН 7,4, содержащего

С,25 мг сывороточного альбумина человека, выдерживают 2 ч при 37" С при постоянном

10 перемешивании. Далее процесс ведут аналогично примеру 6. Постановку РСА осуществляют с гипериммунными сыворотками кроликов, иммунизированных сывороточным альбумином человека. Значения титров

"I5 1 28 тыс. — 1:512 тыс. С нормальными кроличьими сыворотками начиная с разведения

1:10 наблюдалась отрицательная реакция.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать коситель, для сенсиби20 лиэации которого требуется в 30 — 40 раз меньшее количество у -глобулина по сравнению с ",,вестным способом, что повышает экономичность и удешевляет анализ. Кроме того, полученный по предлагаемому спасо25 бу носитель после сенсибилизации может быть использован для анализа сывороток в малых разведениях их, что приводит к повышению .,адежности и снижению трудоемкости анализа.

30 Формула изобретения

1. Способ получения носителя для иммунодиагностики, предусматривающий полимеризацию акролеин", в водно-щелочной среде с образованием сферических микро-.

35 частиц, о т л и ч г ю шийся тем, что, с целью повышения устойчивости суспензии носителя и уменьшения оасхода иммуноглобулинов, пол имеризацию акролеина в водно-щелочной среде проводят при рН 840 12 в присутствии 0,001-0,1 мас.$ водорастворимого красителя, полученные окрашеннье сферические частицы подвергают радикальной полимериэации в присутствии 2 — 5;(, от массы акролеина

45 пероксидных радикальных инициаторов, а затем модифицируют белками в соотношении 1: (0,3 — 1,0) в течение 10 — 18 ч, 2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что в качестве белков для модификации

50 используют желатин, альбумин, казвин.

1620939

Составитель Д.Папковский

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т.Палий

Редактор А.Огар

Заказ 4243 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101

П р и м е ч а н и е. "+"- положительная реакция;"+"- слабоположительная реакция;"-"отрицательная реакция.