Способ получения полипептида, обладающего иммуногенными свойствами нв @ а @

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения вакцин. Изобретение касается композиции, содержащей частицы , имеющие иммунологические свойства , характерные для антигена HBSAg. Эти частицы отличаются тем, что содержат также рецептор полимеризованного альбумина человека. Их получают путем трансформации человеческих или животных клеток вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую S- и пред-5-участки генома вирусного гепатита В, причем данная последовательность ДНК находится под контролем промотора, обеспечивающего эффективную транскрипцию данной последовательности в человеческие или животные клетки, трансформируемые данным вектором . (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 15 51

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЭОБРЕТЕНИЙМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4011814/13 (86) РСТ/FR 85/00044 (07.03.85) (22) Об . 11 .85 (31) 84 03564. (32) 07. 03.84 (33) FR (46) 30.01.91. Бкл. Р 4 (71) Энститю Пастер, Энститю Насьональ де ля Санте э де ля Решерш Медикаль, Сантр Насьональ де ля Решерш

Сьянтифик (FR) (72) Элиан Собзак, Ив Мальпьес, Мари-Луиз Мишель, Пьер Тиоллэ (FR) и Рольф Э. Штреек (DE) (53) 575.224 .2:377.2/ .048 (088 .8) (56) ЕР В 0038765, кл . С 12 N 15/00, .1983. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО ИММУНОГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ

НВ$ Ag

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения вакцин против гепатита В.

Композиция, используемая для приготовления вакцин, отвечающая изобретению, содержит почти сферические полипептидные частицы (или образована из этих частиц), которые обладают иммуногенными и иммунологическими свойствами, характерными для антигена

НВ$ Ag и имеют размеры 18-25 нм, особенно 20-22 мм, и плотности, позволяющие их выделение в интервале плотности 1,20-1,22 г/мм в градиенте плотности на основе CsC1 и такую степень полной чистоты, что отсутствуют части„„SU„„1625332 A 3

2 (57) Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения вакцин. Изобретение касается композиции, содержащей частицы, имеющие иммунологические свойства, характерные для антигена НВ$Ая

Эти частицы отличаются тем, что содержат также рецептор полимеризованного альбумина человека. Их получают путем трансформации человеческих или животных клеток вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую

$- и пред-$-участки генома вирусного гепатита В, причем данная последовательность ДНК находится под контролем промотора, обеспечивающего эффек- Я тинную транскрипцию данной последовательности в человеческие или животные клетки, трансформируемые данным вектором.

Cb цы Dane s и антигены HBS, включая Я

НВС. Предлагаемая композиция отли- ф чается тем, что указанные сферические ( частицы содержат также рецептор поли- ф меризованного человеческого альбуми- фф на. В частности, полипептидные частицы, отвечающие изобретению, могут содержать значительные пропорции, поаипептидов, имеющих hfGB.âåñ порядка 34000 дальтон, и такие полипепти- . в ды составляют по количеству более

103, предпочтительно более 203 от общего количества полипептидов указанных частиц.

Пример i. Построение векторов.

А. Построение плаэмиды pSVS.

1625332

Плазмида pSVS позволяет выразить

S участок (пред-S участок и S ген) под контролем раннего промотора вируса SV 40.

Фрагмент BgIII 2,3 кв выделяют из . рСРIO. Плазмида рСР10 содержит двухзвенный полимер (димер) от головной до хвостовой части генома HBV. Этот фрагмент начинается с десяти нуклео- 10 тидов перед ATG пред-S участка и завершается 1,1 кв после стоп кодона

TAA гена S. Он содержит путативную точку полиаденилирования информационной рибонуклеазы (MRNA) рецептора

HBS Ag, и инициируемую точку транс) крипции гена S.

Используют ранний промотор SV 40, содержащийся в плазмиде PSV 2 gpt (АТСС 37145), в котором ген gpt 20

E. coli слит с PVuII HindIII фрагмен1 та размером 348 п.о. раннего участка

SV 40. Этот фрагмент включает ранний и поздний промоторы иного происхождения, чем репликацйя SV 40 точку ини- 25 циирования транскрипции ранних вест-, ников, и 72 основные пары, которые повторяются последовательно.

Фрагмент BglII размером 2,3 кв пар оснований от рСР10 вставляют в единственную точку HindIII плазмиды р$Ч посредством связывания концов фрагмента ДНК, которые имеют тенденцию к раскрытию посредством ДНК полимеразы Кленова. После изучения рекомбинантных плазмнд отбирают клон (pSV Н44), в котором участок, кодирующий HBS ориентирован относительно промотора $Ч 40 таким образом, что обеспечивает его выражение. Такое построение подтверждается ограничительными картами. Была определена нуклеотидная последовательно на стыке двух фрагментов SV 40 и HPV, Плазмида pSVS построена из трех фрагментов, полученных от трех плазмид: фрагмент 2,5 кв PUuI — XLoI, полученный от pSVH4; фрагмент 1,9 кв

Xhol BglIII, полученный от рСР10; фрагмент 1,0 BamHI, PVuI от pBR 322.

Полученная в результате плазмида

pSVS (5,4 кв) отличается от р$Ч Ы4 отсутствием участка gpt и от последовательностей SV 40 ДНК, следующих за данной последовательностью, наличием фрагмента EcoRI — ВапН1 плазмиды pBR 322.

Б. Построение плазмиды pSVS.

Фрагмент, содержащий dh f r .

Плазмиду pHTV dhfr после линейного выравнивания ферментом PVuI частично расщепляют ферментом HindIII с освобождением некоторых фрагментов, из которых один фрагмент 4400 bp. (пар оснований) содержит LTR от

МИТЧ, с.ДНК от dhfr, интрон от tAg от SV 40, точку полиаденилирования

«в ранних генах SV 40, фрагмент EcoRIPVuI плазмиды pBR 322.

Фрагмент HBV ДНК.

Плазмиду р$Ч$ фрагментируют посредством PVuI, затем HindIII с высвобождением таким образом фрагмента

4676 п.о., содержащего PVuI-PVuII фрагмент, содержащий источник р епликации pBR 322; источник репликации и ранний промотор .вируса SV 40; фрагмент BglII размером 2,3 т.п.о. от

HBV, содержащий участки, кодирующие пред-$ и S ген, а также сигнал полиаденилирования этого гена; фрагмент

BamHI — HindIII плазмиды pBR 322.

Лигирование данных фрагментов..

После очистки данные две фрагмента соединяют по сайтам PVuI H. HindIII так что восстанавливается устойчивость pBR 322 к ампициллину.

В рекомбинантном векторе зоны транскрипции S участка и гена dhfr ориентированы в одинаковом направлении и разделены примерно 300 п.о. плазмиды рВК 322.

ДНК, кодирующую dhfr, получают также от р$У2 dhfr (АТСС 337146), р$ЧЗ dhfr (АТСС 37147) или р$Ч5

dhfr (АТСС 31148) .

Расположение гена dhfr таким образом, что он находится под контролем слабого промотора (LTR от

MNTV) и гена HBV таким образом, что он находится под контролем сильного промотора (раннего промотора SV 40), повышает эффективность экспрессии гена.

Пример 2. Трансфекция животных клеток.

Перенос и выражение плазмиды pSVS

dhfr в CHO. Трансформируют клетки

CHO dhfr плазмидой pSUS dhfr, продукт. этих клеток испытывают методом радиоиммуноанализа (RIA) в поверхностном слое клеточных культур. 60Х клонов

dhfr представляет собой HBS Ag .

Скорость синтеза HBS Ag была относительно. низкой между 1 и 20 мг/10 клеток в течение 24 ч.

1625332

40 5 идентична иммунологической силе вак50

Увеличение последовательностей

HBS.

Культивирование клонов СНО

HBS Ag в присутствии метотриксате (МТХ), аналога фолиевой кислоты в ингибиторе dhfr обуславливает увеличение числа воспроизведений гена

dhfr, что приводит к увеличению количества фермента dhfr.

Концентрации МТХ составляют 50, 100 или 140 нМ на первом этапе и

i,5, 10 или 25 мкмоль на втором этапе.

Суммарно отбирают. примерно 150 стойких к MTX клонов для продуцирования

HBS Ag при этом увеличение синтеза

HBS Ag в значительной степени меняется от одного клона к другому как на первом, так и на втором этапе.

Число копий последовательности

HBV на кпетку в различных клонах определяют путем гибридизации целлюлозного фильтра согласно методике с использованием в качестве пробы клонированной BBV — ДНК, меченой . р .

Для одинаковой дозы МТХ это число значительно меняется от одного.клона к другому в пределах от 100 до

500.

Последовательности HBU присутствуют в интегрированной форме,рефоретические профили для разных клонов в основном сопоставимы.

Количество специфических PHK последовательностей НВЧ анализируют путем молекулярной гибридизации, оно пропорционально скорости продуцирования НВБ Л . Более того, для одинаковой дозы MTX (50 нм) количество специфических PHK постоянно в различных анализируемых клонах. Выявлено два класса РНК, Один основной

2, 1 т.п.о. и другой неосновной

2,5 т.п.о. Изучение этих PHK посредством карты $1 нуклеазы показывает наличие основного участка инициирования на пред-8 в положении 3157, соответствующем PHK 2, 1 т.п. о., и другого неосновного инициирования в промоторе SV 40, соответствующего РНК

2,5 т.п.о.

Пример 3. Анализ частиц

HBS Ag Анализ осуществляют на частицах, полученных 37БА5. Поверхностные слои, соответствующие нескольким сборам в стационарной фазе в течение 24 ч, соединяют вместе. Частицы HBS Ag очишают путем двух последовательных ультрацентрифугирований в градиенте плотности CsCl с последующим скоростным ультрацентрифугированием,в сахарозном градиенте. Частицы HBS Ag имеют плотность 1,20. В электронном микроскопе обнаруживают, что они представляют собой сферические частицы средним диаметром 22 нм, морфологически аналогичные частицам человеческого происхождения. Частиц трубчатой формы не обнаруживают.

После диссоциации частиц при

100 С в течение 5 .мин в присутствии о

ДТТ полипептиды анализируют методом электрофореза на полиакриламидном геле в, присутствии SDS. Гель окрааивают солями серебра. Наблюдают три полосы, соответствующие полипептидам 22 300, 26 100 и 34000 дальтон.

Относительная интенсивность скрашивания этих трех полос позволяет определять пропорции трех белков, составляющие 54, 19 и 27Х. После мечения

35 S метионином в условиях in vivo очищенные частицы подвергают иммунооса:кдению посредством анти-HBS сыворотки, а затем белки анализируют посредством электрофореза. На авторадиограмме обнаруживают три описанные полипептида в тех же пропорциях.

Наличие рецептора для pHSA на поверхности частиц обнаруживают методом радиоиммуноанализа в твердой фазе. Рецепторы обнаружены в поверхностном слое, а также на очищенных частицах.

Пример 4. Определение иммунизации.

После ввода в препарат частиц гидрата окиси алюминия до концентрации

0,17 этот препарат используют для иммунизации мьппей Balb/с. Иммунологическая сила клеточных частиц цины от гепатита В, выпускаемого под торговой маркой HBV АСВ (и получаемого из сыворотки люден - доноров с содержанием естественного НВЗ Ag) .

507.-ная эффективная доза составляет

0,04 мкг для клеточных частиц и

0,03 мкг для HBUAC (торговая марка института Пастера) .

Таким образом, вектор pSUS после интеграции в клеточную ДНК позволяет осуществить синтез и выцеление пустых оболочек вируса НВЧ в форме час» тиц 22 нм. Удаление большей части . генома HBV и, в частности гена, коди1625332 ности этих частиц является дополнительным аргументом, для использования этой системы при получении вакцины против гепатита В.

Формула изобретения

Составитель Т. Забойкина

ТехРед M.Моргентал

Корректор JI.

Редактор О. Спесивых

Заказ 205 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 рующего белок капсид, исключает продуцирование полностью инфекционных вирусных частиц. Этот вектор несет также звено транскрипции гена бурой водоросли dhfr, которое после ввода в dhfr обеспечивает их увеличение в присутствии NTX за счет увеличения гена.

Синтез HBS Ag за счет блоков СНО является очень стабильным даже при отсутствии МТХ. И эта стабильность сохраняется в течение шести меся.цев, что составляет примерно 300 генераций. В некоторых случаях наблюдается. еще небольшое . самопроизвольное увеличение продуцИруемой

HBS Ag

Кроме того, изобретение позволяет получить клоны, которые образуют иммуногенные частицы со значительной генетической стабильностью.

Частицы HBS Ag 22 мм, синтезированные клетками СНО, имеют такую 25 же иммуногенность, как H НВЧ АСВ, . который является препаратом частиц сывороточного происхождения. Скорости продуцирования HBS Ag сопоставимы со скоростями продуцирования при промышленном использовании .

Присутствие pHSA рецептора на поверхl

Способ получения попипептида, обладающего иммуногенными свойствами НВЫ Ag,ïðåäóñìàòðèâàþùèé констру ирование рекомбинантной плазмидной

ДНК со вставной части ДНЕ вируса гепатита В под контролем вирусного промотора, трансформацию полученной

ДНК штаммов культивируемых клеток животного, отбор штаммов продуцентов, культивирование, выделение и очистку целевого продукта, о т л и ч а ю— шийся тем, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pSVS

dhfr со вставкой Bglll фрагмента вируса гепатита В размером 23 кв под контролем раннего промотора SV 40, трансформируют полученной ДНК штамм

СНО dhfr, а отбор штамма-продуцента осуществляют в присутствии МТХ в концентрации 50, 100, или 150 нмоль, затем в концентрации 5, 10 или

20 ммоль и блот-гибридизацией с используемой в качестве ДНК вЂ” зонда;

НВК вЂ” ДНК, меченной р.