Фрагмент днк amyamyllich i, кодирующий гибридную термостабильную -амилазу, способ его конструирования, рекомбинатная плазмидная днк prtlich, кодирующая гибридную термостабильную -амилазу, способ ее конструирования и штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент термостабильной -амилазы

 

1. Фрагмент ДНК amyamyllich I, кодирующий гибридную термостабильную α-амилазу, полученный в результате замены нуклеотидных остатков с 562 по 690 на гомологичный фрагмент ДНК, кодирующий часть α-амилазы Bacillus licheniformis без регулярной области, со следующей нуклеотидной последовательностью фрагмента amyamyllich I: 2. Способ конструирования фрагмента ДНК amyamyllich I, заключающийся в том, что однонитевую ДНК рекомбинантного фага M13mWBamy_Δ, содержащего часть фрагмента ДНК, кодирующего α-амилазу B.amyloliquefaciens, выращенного на клетках Escherichia coli TGl, смешивают с фрагментом ДНК, кодирующим часть гена α-амилазы B.licheniformis, ограниченную последовательностями узнавания рестрикционных эндонуклеаз KpnI и HindII, полученную смесь нагревают до 100^oC, медленно охлаждают до 20^oC, затем достраивают однонитевую ДНК до двунитевой Кленовым фрагментом ДНК полимеразы I E.coli, затем обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4, полученной смесью трансфецируют клетки E.coli TGl, после трансфекции анализируют полученные рекомбинантные фаги на наличие в их ДНК нуклеотидных замен, отличающих фрагмент ДНК, кодирующий α-амилазу B.amyloliquefaciens, от фрагментов ДНК amyamyllichi, затем выделяют двунитевую ДНК фагов, содержащих указанные замены, смешивают с ДНК плазмиды pNS15BamHI, полученную смесь гидролизуют эндонуклеазами рестрикции PstI и HindIII, продукты гидролиза обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4, трансформируют клетки E. coli TGl, отбирают клоны, продуцирующие α-амилазу и соответственно содержащие плазмиду pTG29lich 1 с фрагментом ДНК amyamyllichi.

3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pRTlich 1, кодирующая термостабильную α-амилазу размером 7740 п.о., содержащая: Pst1-BamH1 - фрагмент плазмиды pRT5 размером 2430 п.о. с геном, необходимым для репликации в клетках Bacillus subtilis; BamHI-HindIII - фрагмент плазмиды pRT5 размером 1804 п.о. с геном устойчивости клеток Bacillus sibtilis к эритромицину; PstI-EcoRI - фрагмент плазмиды pBR322 размером 309 п.о. с частью гена устойчивости к тетрациклину; PstI-EcoRI - фрагмент плазмиды pRT5 размером 1377 п.о. с регулярной областью, необходимой для экспрессии гибридного гена α-амилазы и Isl - элемента Escherichia coli, и частью фрагмента ДНК amyamyllich 1; EcoRI-HindIII - фрагмент фага M13mWBamy_Δ размером 635 п.о. с частью гена гибридной термостабильной α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, в котором нуклеотидные остатки с 562 по 690 заменены на гомологичный фрагмент ДНК, кодирующий часть α-амилазы Bacillus licheniformis; HindIII-HindIII - фрагмент ДНК плазмиды pRT5 размером 1184 п.о. с частью гена α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens; уникальные сайты рестрикции: PstI, EcoRI, 3HindIII, BamHI; гены: Ori - ген, кодирующий белок и область начала репликации плазмиды pRT5;
E^R_m - ген, обеспечивающий синтез метилазы, определяющей устойчивость клеток B.subtilis к эритромицину;
amyamyllichi - структурный ген гибридной термостабильной α-амилазы.

4. Способ конструирования плазмиды pRT lich 1, заключающийся в том, что ДНК плазмиды pTG29lich 1 смешивают с плазмидой ДНК pRT_Δ, содержащей фрагмент ДНК amyamyllichi, подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoRI, полученные фрагменты соединяют ДНК-лигазой, затем смесью рекомбинантных молекул трансформируют клетки B. subtilis 2lrecE4any4, трансформанты высевают на среду с эритромицином и амилопектиназуром и отбирают клоны, продуцирующие α-амилазу.

5. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ B-4632 - продуцент термостабильной α-амилазы.