Штамм бактерий sтrертососсus faecalis - продуцент рестриктазы sfa n @

 

Д1)5 С 12 N 1/20, 9/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

Н АВТОРСКОМУ СИИДВТОВ С ТВ У

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ГИ И ГКНТ СССР

Щ) 4621999/13 (22) 19.12.88 (46) 30.04.91. Бюп. Р 16 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологически институт биологически активных веществ (72) Г.Д. Серов, С.Х. дегтярев, Л.И. Пучкова, Л.Л. Корсуни Н.И. Речкуиова (53) 577.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 1442546, кл. С 12 N 9/12, 1987.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частнос;ти к обнаружению микроорганизма,способного синтезировать сайт-специфическую рестриктазу и расщепляющую последоватепьность нуклеотидов GCATC

Целью изобретения является выявление штамма Streptococcus faecalis

ВКПИ В-4426 (555), продуцирующего рестриктазу Sfa N 1 с повышенным выходом.

Штамм Streptococcus faecalis 555

В-4426 — продуцент рестриктазы БЕа М 1, узнаюцей и раСцепляюцей последовательность нуклеотидов GCATC N

Штамм характеризуется следующими свойствами.

„,SU„„16452

2 (54) LITAIBI БАКТЕРИЙ STPZPTOCOCCUS

FAECALIS — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗИ

БГА И1 (54) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является ш явление штамма Streptococcus f aecal is ВКПМ

В-4426 (555), продуцируюцего рестриктазу Sfa N 1 с повышенным выходом. штамм получен в результате селекционной работы с музейными культурами, растет на простой дешевой питательной среде отечественного производства, обеспечивает выход из 1 r влажной биомассы 2000 ед. фермента, что в 3 раза больше, чем известного. а

Иорфологические. Клетки — в виде слегка овальных мелких грамположи-. тельных неподвижных кокков, располагающихся поодиночке, попарно или в. виде коротких цепочек. На плотной питательной среде формируют мелкие диа- р метром до 1 мм, слегка выпуклые, круглые с ровным краем, блестящие, полупрозрачные пастообразной консистенции колонии. При росте в питательном бульоне — равномерное помутнение.

Физиологические и биохимические.

В первые сутки вырастает при темперао туре 45 С, на вторые — при 10 С. Растет при рН 9,6 и в молоке в присутствии 0,1Х. метиленового синего, вызывая его редукцию. Растет на питательном агаре в присутствии теллурита калия, который при этом восстанавливается. На средах Гисса вызыва1645293 ет ферментацию без газообразования мелибиозы, маннозы, галактозы, глю" козы, лактозы, сахарозы, мальтозы, арабинозы, маннита. Не ферментирует рамнозу, рафинозу, трегалозу, крах,мал, инозит, дульцит. Ферментнрует в аэробннх и не рерментирует в анаэробных условиях глицерин. Проба с малонатом отрицательная. Индол, серо- 1р водород не образует. Дает отрицательные реакции с метиповым красным и на ацетон, оксидазу, каталазу и уреазу.

Нитраты не редуцирует. Желатин не гидролизует, не обладает лизин- и орннтнндекарбокснлазой, проба на аргининдигидролаэу положительная.

Отношение к антибиотикам. Клетки устойчивы к пенициллину,,ампицнллину, ионоинцину, канамицину, оксициллину, 20 ристомицину, сульфатиазолу, иетициллину чувствительны к стрептомицину, неомицину, олеандромицину, эритромицину, иовобиоцину, гентамицину и рнфампицин у о 25 затаим хранится в лиофильно-высушенном состоянии и на полужидкой питательной среде под слоем вазелинового масла.

Для культивирования клеток приме- 3р няется питательная среда следующего состава, г/л: гидролизат казеина 20, глюкоза 10, дрожжевбй экстракт 5, натрий хлористый 5, рН среды 7,2.

Культивирование проводят прн температуре 30 С с хорошей аэрацией до

0 поздней логарифмической фазы роста.

Выход влажных клеток составляет 2,43,0 г/л питательной среды.

Выход фермента составляет 2000 ед. 40 акт./г сырой биомассы, что более чем в 3 раза выше, чем известного

Полученная рестриктаза Sfa N 1 характеризуется следукк нми свойствами: узнает и специфически расщепляет 45 последовательность нуклеотидов GCATC

145/Н9 оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,2; оптимальная температура действия

37 оптимальная концентрация ионов

ИаС1 — 150 шИ, MgC1 - 5-15 шИ.

Фермент стабилен в течение не менее 6 мес,. при температуре -20 С, своо

55 боден от примесей неспецифических экэо- и эидонуклеаз, фосфатаз.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Клетки выращивают в пробирке на скошенном питательном

arape с добавлением 5 г/л дрожжевого экстракта при температуре 30 С о в течение 16-18 ч. Этот объем инокулята равномерно вносят в 4 колбы с объемом 200 мл той же питательной среды. Культивирование в жидкой питательной среде проводят на термостатнрованной качалке. Полученную культуральнув жидкость центрифугируют при

5 тыс,об/мин в течение 30 мин. Выход влажных клеток составил 2,4-3,0 г/л питательной среды.

Пример 2. 10 r биомассы

Streptococcus faeca1is 555 суспендируют в 30 мл 0,02 И трис-НС1 буфера, рН 7,5, содержащего 1 10 И/3-меркаптоэтанол и О, 1Z тритон Х-100,и разрушают на ультразвуковои дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость наносят на колонку с бногелем А 0,5 m (Bio-Rad) объемом 500 мл, уравновешенную 0,02 И калийфосфатным буфером, содержащии 1 10 И -меркаптоэтанол, 5 10 И ЭДТА, 0,8 И NaC1 и 0,17. тритон Х- 100 (буфер А). Фермент элюируют тем же буфером со скоростью 20 мл/ч.

Фракции объемом 10 мл собирают н анализируют на активность фермента. Диализ фермента проводят против 2 л

0,02 И калийфосфатного буфера, рН 7,5 содержащего 1 ° 10 И Р-меркаптоэтанола и 5 10 ЭДТА (буфер В), иеняя буфер дважлы. Диализат наносят на колонку объемом 30 мл с бензнл-ДЕАЕ целлюлозой (" Sigma", CLIA), уравновешенную буфером В. Колонку промывают буфером

В, адсорбированный фермент элюируют

300 мл градиента NaC1 (0,0-1,0 М) в буфере В. Фракции, элюируемые при

0,45-0,55 И НаС1, содержавшие рестриктазу, объединяют и диализуют против

2 л буфера В, меняя его дважды. Фермент после днализа наносят на колонку с сюсфоцеллкатозой (P-11 Whatman) объемом 10 мл, уравновешенную буферои В, и промывают колонку тем же буфером. Элюцию фермента проводят

200 мл градиента NaC1 (0,0-1,0 И) в буфере В. Фракции, содержащие рестриктазу,элюируемые при 0,43-0,55 М йаС1, объединяют н диализуют против

2 л буфера В. Затем проводят рехроматографию фермента на фосфоцеллюло3e P-11 объеиом 2 мл для концентрирования фермента. Элюцию проводят 40 мл

1645293

Составитель И. Привалова

Редактор А. Иаковская Техред М,яндык Корректор М. Шароши

Заказ 1322 Тираж 383 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета ло изобретениям н открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Нроизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 градиента ИаС1 (0,0-1,0 И). Фракции элюируемые при 0,5-0,55 И NaC1, объединяют и диалиэуют против буфера В, содержащего 0,1 И ИаС1 и 50Х-ный глицерин.

Ферментный препарат хранится при

-20 С. Выход фермента 2000 ед.акт./г биомассы, активность 20000 ед./мл.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления

1 мкг Д1!К фага ф С1 857 в течение часа при температуре 37 С.

Полученный штамм обладает следуюциии преимуществами по сравненин с известным:

5 — обеспечивает повышенный выход рестриктазы Sfa N 1; — растет на более доступных дешевых питательных средах отечественного производства.

Формула изобретения

11таим бактерий Streptococcus

faecalis ВКПИ В-4426 — продуцент рестриктазы Sfa N 1.