Способ дифференциальной диагностики идиопатической тромбоцитопенической пурпуры и гипопластической анемии

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при дифференциальной диагностике заболеваний крови, особенно из атипичных форм. Цель - повышение точности диагностики. Иммунологический способ основан на специфической реакции взаимодействия сенсибилизированных антигенсвязывающих лимфоцитов больного с тромбоцитарным антигеном, включающий выделение из крови больного лимфоцитов, их отмывку от плазменных факторов, инкубацию первой порции лимфоцитов с тромбоцитарным антигеном, отмывку лимфоцитов от несвязанного антигена и последующую инкубацию с второй порцией отмытых лимфоцитов. При количестве лимфоцитарных агглютинатов, равном и более 2,5% относительно контроля , диагностируют идиопатическуютромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), а при результате менее 2,5% - гипопластическую анемию (ГА). При атипичных формах ИТП и ГА точность диагностики повышается до 89 -93%. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я) G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY. СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4347738/.14 (22) 22.12.87 (4б) 07.05.91. Бюл. М 17 (71) Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения УЗССР (72) О.M.Màëèêîâ, Ф. Ю, Гариб и У.А.Алты баев (53) 615.375(088.8) (56) Руководство по гематологии./ Под, ред.

А.И.Воробьева.М„1985, т.2, с. 138 — 195, (54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИДИОПАТИЧЕСКОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИЧЕСКОЙ ПУРПУРЫ И

ГИПОПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ

{57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано при дифференциалькой диагностике заболеваний крови, особенно из атипичных форм. Цель — повыИзобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано при диагностике заболеваний крови.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается тем, что из крови больного выделя1от лимфоциты, отмывают от плазменных факторов, первую порцию лимфоцитов инкубируют с тромбоцитарным антигеном, затем их отмывают ат несвязанного антигена и повторно инкубируют с второй порцией отмытых лимфоцитов, и при количестве лимфоцитарных агглютинатов 2,5% диагностируют ИТП, а при результате < 2,5% диагностируют ГА.

Сущность способа заключается в том, что производят исследование крови больно. Ж,» 1647404 А1 шение точности диагностики. Иммунологический способ основан на специфической реакции взаимодействия сенсибилизированных антигенсвязывающих лимфоцитов больного с тромбоцитарным антигеном, включающий выделение из крови больного лимфоцитов, их отмывку от плазменных факторов, инкубацию первой порции лимфоцитов с тромбоцитарным антигеном, отмывку лимфоцитов от несвязанного антигена и последующую инкубацию с второй порцией отмытых лимфоцитов. При количестве лимфоцитарных агглютинатов, равном и более 2,5% относительно контроля, диагностируют идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), а при результате менее 2,5% — гипопластическую анемию (ГА). При атипичных формах ИТП и

ГА точность диагностики повышается до

89 — 93%. го, при этом: из крови выделяют лимфоциты; лимфоциты отмывают от плазмы.

Тщательная отмывка от плазмы обяза- фь. тельна, так как нами было выявлено, что при ( данной патологии в плазме больного содер- ф. жатся факторы, искажающие результаты исследования и снижающие точность способа.

В роли таковых могут выступать аутоантитела„направленные против тест-антигена, эндогенные токсины, блокирующие факторы и др

Полученные лимфоциты инкубируют с заранее приготовленным тромбоцитарным антигеном. На этом этапе антиген специфически связывается с мембранами сенсибилизированных лимфоцитов.

1647404

10

Лимфоциты отмывают от несвязанного

3HTL1l8ll3, чтобы исключить его участие в дальнейшем процессе, Полученные лимфоциты повторно инкубируют с новой порцией отмытых от плазмы лимфоцитов того же больного. При этом сенсибилиэированные лимфоциты новой порции через антигенный мостик связываются с ранее инкубированными лимфоцитами, образуя агглютинаты.

Результат исследуют под микроскопом, подсчитывая процентное отношение агглютинатов к свободно лежащим лимфоцитам.

При количестве лимфоцитарных агглютинатов равном и более 2,5$ ставится диагноз

ИТП, а при результате менее 2,5;4 диагностируют ГА.

Приготовление антигена иэ тромбоцитов человека, Берут из локтевой вены 10 — 12 мл донорской крови.на гепариновый раствор (по

25 ед.гепарина на 1 мл крови). Центрифугированием (10 мин при 1500 об/мин) осаждают лейкоциты и эритроциты. Надоса>. ную жидкость, .которая содержит тромбоциты, пере осят в другую силиконированную пробирку и отмывают физиологическим раствором (0,85,(,) три раза с помощью центрифугирования (при 3000 об/мин, 20 мин). Затем подсчитывают число тромбоцитов общепринятым способом, делают мазок иэ осадка тромбоцитов, высушивают его; окрашивают по Романовскому-Гимэе и микроскопируют (90х10) общепринятым способом. ilp«этом определяют в нем наличие тромбоцитов.

8 отдельных случаях в мазке обнаруживаются не только тромбоциты, но и эритроциты и лейкоциты донора, В этих случаях проводят дополнительную очистку тромбоцптов. Для этого осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и центрифугируют s проГирке (при 1000 об/мин, 5 мин), Затем надосадок, содержащий тромбоциты, . переносят в другую пробирку и вновь центрифугируют (при 3000 об/мин, 20 мин), Надосадок удаляют, а осадок, состоящий из тромбоцитов, разводят в 2 мл физиологического раствора и разрушают при помощи последовательного замораживания в морозильнике бытового холодильника и размораживания с подогревом до 40 С в теплой воде 3-4 раза, После этого концентрацию белка в антигоне иэ тромбоцитов доводят до рабочей концентрации 280 мкг/мл. Антиген разлива|от по 0,5 мл в стерильные ампулы, их запаивают, эамораживают и сохраняют в морозильнике .бытового холодильника при

4 С, Антиген, приготовленный указанным способом, пригоден в течение 2-2,5 мес.

Работа ведется в асептических условиях.

Выделение лимфоцитов проводят общепринятым способом,.2 мл крови больного, взятой на гепариновый раствор (25 ед.гепарина на 1 мл крови), разводят в соотношении 1;2 средой 199. Осторожно наносят кровь на раствор фиколла (3 мл) с плотностью 1,077 г — мл в центрифужную пробирку и центрифугируют при 1500 об/мин

30 мин. После центрифугирования клетки крови разделяются на две фракции; белый слой, состоящий из лимфоцитов, располагается на поверхности фиколла, а эритроциты и гранулоциты — на дне пробирки.

Лимфоциты собирают пастеровской пипеткой в коническую пробирку и отмывают три раза средой 199 с центрифугированием при 800 об/мин 5 мин. Подсчет лимфоцитов проводят в камере Горяева общепринятым способом и доводят их концентрацию до

2 . 10 клеток в 1 мл.

Регистрация антигенсвязывающих лимфоцитов в крови больных.

В опытной пробе к 0,1 мл лимфоцитов добавляют 0,1 мл антигена из тромбоцитов, встряхивают и инкубируют 30 мин при 37 С.

После инкубации проводят отмывку лимфоцитов от лишнего несвязанного антигена в среде 199 путем центрифугирования в течение 5 мин при 800 об/мин.

К отмытым от антигена клеткам добавляют вторую порцию лимфоцитов (0,1 мл), смесь встряхивают, центрифугируют 5 мин при 800 об/мин, Инкубируют 30 мин при

37 С, В контрольную пробу вместо антигена добавляют равное количество среды 199, Из осадка готовят мазки, которые быстро высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимзе, Мазки микроскопируют, подсчитывая в них 200 лимфоцитов, отмечая среди них агглютинаты, состоящие иэ 2-3 лимфоцитов, которые представляют собой антигенсвязывающие клетки, Число агглютинированных лимфоцитов выражают в ь к общему числу подсчитанных лимфоцитов.

Результат выражают разностью между опытной и контрольной пробами.

Пример I. Приводят примеры клинического применения способа. Типичная форма ИТП. Больная Л., 23 r. поступила в клинику с жалобами на кровоподтеки под кожу конечностей, десневое кровотечение.

Направительный диагноз . ИТП. Болеет в течение 3 лет, неоднократно лечилась гемостатическими препаратами и кортикостероидами, но кровь и ее компоненты не переливались. Анализ крови: НВ-106 г/л, эритроциты 4,85 10 кл/л, лейкоциты

1647404

6,5 10 кл/л, лимфоциты 20, тромбоциты

4,3 10 кл/л, При исследовании костного

9 мозга последний богат клеточными элементами, лимфоцитов 5,2, множество мегакариоцитов (в.двух препаратах подсчитано 20 мегакариоцитов, из них 12 не функционирует, 8 функционирует слабо), Содержание антигенсвязывающих лимфоцитов составило

6, чем подтвержден направительный диагноз: ИТП.

Проведено консервативное лечение с последующей операцией — спленэктомией, Состояние больной быстро улучшилось (кровоподтеки полность<о рассосались, увеличилось количество тромбоцитов—

466,0 10 кл/л, лейкоцитов 12,3 10 кл/л.

Пример 2, Атипичная форма ИТП.

Больная К., 14 лет, госпитализирована с направительным диагнозом: ГА. Жалобы при поступлении на носовое, маточное и десневое кровотечение. В течение двух лет безуспешно лечилась трансфузиями крови и ее компонентами. Объективно: состояние больной при поступлении тяжелое, кожные покровы бледны, множественные кровоподтеки по всему телу разного размера и давности, регионарные лимфоузлы не увеличены. Пульс слабого наполнения и напряжения, учащен до 108 уд/мин, артериальное давление 100/60 мм рт.ст. Анализ крови. гемоглобин 40 г/л, эритроциты 2,0 10 кл/л, 12 тромбоциты 16,0 10 кл/л, лейкоциты

3,7 10 кл/л, лимфоциты 45 На основании клиника — гематологических данных больной был поставлен предварительный диагноз: гипопластическая анемия. Но, поскольку количество антигенсвяэывающих лимфоцитов, определенное предлагаемым способом, составило 7, был поставлен другой диагноз: хроническая рецидивирующая форма идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, осложнение— постгеморрагическая анемия, Было назначено соответствующее лечение, состояние улучшилось, кровоподтеки рассосались, увеличилось количество гемоглобина до 100 г/л, эритроцитов до

3,5 10 кл/л, лейкоцитов до 7,8 10 кл/л, снизилось содержание лимфоцитов до 31, увеличилось количество тромбоцитов 38,6

10 кл/л. Последующее наблюдение и данные миелограммы подтвердили правильность нашего диагноза. Миелограмма: костный мозг многоклетачен, красный росток раздражен, лимфоциты 17%, множество мегакариоцитов (из 14 подсчитанных функционируют 2).

Пример 3. Типичная форма ГА. Больной M., 10 лет nocòóïèë в клинику с жалобами на слабость, носовое кровотечение, множественные кровоподтеки, шум в ушах и затемнение перед глазами, Направи ельный диагноз; ГА. В течение года многократно лечился в различных лечебных учреждениях с малым клиническим эффектом. Объективно: состояние бального тяжелое, кожные покровы бледные, множественные кровоподтеки, носовое и десневое кровотечения. Анализ крови: гемоглобин 60 г/л, эритроциты 1,8 . 10 кл/л, 12Р лейкоциты 1,15 10 кп/л, лимфоциты 75о, 9 тромбоциты 2,24 10 кл/л. Миелограмма:

g костный мозг малоклеточен, повышено содержание лимфоцитов 4Х8 . Б двух препаратах костного мозга найден всего один мегакариоцит, и тот не функционирует. Содержание антигенсвязывающих лимфоцитав по предлагаемому способу 1,5;< „что подтверждает направительный диагноэ— гипопластическая анемия, После проведения целенаправленного консервативного лечения многократным переливанием крови стойкого улучшения клинико-гематологических показателей не наступило {кровоподтеки не рассосались, осталось сниженным содержание гемоглобина 70 г/л, эритроцитов 2,0 10 кл/л, а лимфоцитов повышенным 63%), Учить<вая малоэффективность консервативного лечения. больному проведено опера<ивное лечение — пересадка аллогенного костного мозга от родственника, после чего наступило улучшение.

Пример 4. Атипичная форма ГА, Больной P., 13 лет, поступил в клинику с направительным диагнозом; ИТП. Жалобы при поступлении на носовое кровотечение и кровоподтеки, общу<о слабость, Обьективно: состояние средней тяжести, кровоподтеки под кожу нижних конечностей и предплечий, незначительное носовое кровоте <ение. Анализ крови: гемоглобин 82 г/л, эритроциты 3,1 10 кл/л,лейкоциты 4,3

10 кл/л, лимфоциты 32, тромбоциты

34,6 10 кл/л, Содержан< е антигенсвяэы9 вающих лимфоцитов 1, на основании чего диагноз ИТП изменен на ГА. После адекватной терапии исследована миелограмма; костный мозг умеренно клеточен, повышено содержание лимфоцитов 39<, мегакариоцитов мало, (в двух препаратах найдено всего 4 мегакариоцита, из них функционирует только один), Анализ крови после лечения: гемоглобин 95 г/л, эритроциты 3,5 . 1012

9 кл/л, лейкоциты 3,7 10 кл/л, лимфоциты

66,,ь, тромбоциты 92,3 10 кл/л, Наступило

1647404 вследствие перечисленного становится возможной экономия затрат на диагностику и лечение больных ИТП и ГА, Формула изобретения

Составитель П,Бонарцев

Техред M. Морге нтал Корректор А.Осауленко

Редактор А,Шандор

Заказ 1395 Тираж 418 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 клиническое состояние и в дальнейшем было произведено оперативное лечение— сплензктомия.

fl р и м е р 5. Здоровый донор костного мозга И., 27 лет, ближайшее время ничем не болел. Анализ крови; гемоглобин 134 г/л, эритроциты 4,3 10 кл/л, лейкоциты

7,6 10 кл/л, лимфоциты 24 >, тромбоциты

286,0 10 кл/л. Миелограмма: костный

g мозг богат ядросодержащими элементами, лимфоцитов 14,8 („мегакариоцитов много (B двух препаратах 14 мегакариоцитов, иэ них 12 функционирукццие), Антигенсвязывающих лимфоцитов по предлагаемому способу 1,2 7,.

Выполнение дифференциальной диагностики ИТП и ГА предлагаемым способом, по сравнению с известными, обеспечивает: ускорение диагностического исследования в 2-3 раза по сравнению с прототипом (2,5-3 ч против 6-8 ч); дифференциальную диагностику ИТП и

ГА по анализу крови; снижение травматичности исследования,по сравнению со способами диагностики по костному мозгу; . повышение точности диагностики ИТП . и ГА и особенно их атипичных форм; сокращение объема крови и ее компонентов, затрачиваемых на безрезультатное лечение при ошибочном диагнозе;

5 При атипичных формах ИТП и ГА точность диагностики повышается до 8993 .

Способ дифференциальной диагностики идиопатической тромбоцитопенической пурпуры и гипопластической анемии путем исследования клеток крови, о т л и ч а ю15 шийся тем, что, с целью повышения точности способа, из крови выделяют лимфоциты, часть из которых инкубируют с тромбоцитарным антигеном с конечной концентрацией белка 140 мкг/мл в течение

20 30 мин при 37 С, отмывают и соединяют с равным объемом другой части нативных лимфоцитов, далее готовят мазки, окрашивают их, подсчитывают процентное содержание агглютинированных лимфоцитов, 25 сравнивают с контролем, не содержащим тромбоцитарного антигена, определяют разность показателей и при ее величине, равной и более 2,5%, диагностируют идиопатическую тромбоцитопеническую

30 пурпуру, а при величине менее 2,57; диагностируют гипопластическую анемию.