Способ отбора регуляторов роста растений цитокининовой и ауксиновой природы

 

Изобретение относится к области физиологии растений и может быть использовано для поиска гормоноподобных регуляторов роста растений, использование которых является перспективным направлением химизации сельского хозяйства. Целью изобретения является упрощение и увеличение производительности процесса отбора регуляторов роста цетокининовой и ауксиновой природы. Способ заключается в контактировании испытуемых соединений со специфическими антителами к гормонам, полученным при иммунизации животных конъюгатами гормонов с белком. Антитела в данном случае рассматриваются как модели рецепто.рных сайтов гормонов, а их способность взаимодействовать с испытуемым соединением оценивают твердофазным иммуноферментным методом (ТФ ИФА). Исследуемое вещество и раствор гормона (эталон) приводят в контакт с полученными антителами к гормону. Затем сравнивают способность тестируемых веществ и эталона ингибировать связывание антптеп к гормону, конъюгированному с белком и иммобилизованному на полистироле. Количество антител, сорбированных на иммобилизованном гормоне, оценивают с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. 3 табл. W Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ .СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4482978/13 (22) 26.07.88 (46) 07.04.91. Бюл. N. 13 (71) Институт биологии Башкирского филиала АН СССР (72) Г,Р.Кудоярова, С.Ю.Веселов, Е.П.Чередова, 8.3.Гюяи-Заде и А.Р,Мустафина (53) 58.07 (088.8) (56) Природные регуляторы роста растений.

/Под ред. В.И. Кефели.-M., 1976.

Schnutz. R.Y. et a l. Cytoki n i n s.

Development of a potent antagonist; Proc.

Nat. Acad. Sci. ОЯА 1971, 68, М 10. р. 2608—

2610. (54) СПОСОБ ОТБОРА РЕГУЛЯТОРОВ Р0СТА РАСТЕНИЙ ЦИТОКИНИНОВОЙ И АУКСИНОВОЙ ПРИРОДЫ (57) Изобретение относится к области физиологии растений и может быть использовано для поиска гормоноподобных регуляторов роста растений, использование которых является перспективным направлением химизации сельского хозяйства, Целью изобретения является упрощение и

Изобретение относится к физиологии растений и может быть использовано для поиска гормоноподобных регуляторов роста растений, использование которых является перспективным направлением химизации сельского хозяйства.

Целью изобретения является упрощение и увеличение производительности процесса отбора регуляторов роста цитохининовой и ауксиновой природы.

Пример 1. Получение конъюгата зеатина с белком и антизеатиновой сыворотки.

„„ Ы„„1640654 А1 (siis 6 01 N 33/53, А 01 N 65/00 увеличение производительности процесса отбора регуляторов роста цетокининовой и ауксиновой природы. Способ заключается в контактировании испытуемых соединений со специфическими антителами к гормонам, полученным при иммунизации животных конъюгатами гормонов с белком. Антитела в данном случае рассматриваются как модели рецепторных сайтов гормонов, а их способность взаимодействовать с испытуемым соединением оценивают твердофазным иммуноферментным мет- дом (ТФ ИФА), Исследуемое вещество и раствор гормона (эталон) приводят в контакт с полученными антителами к гормону. Затем сравнивают способность тестируемых веществ и эталона ингибировать связывание антител к гормону, конъюгированному с белком и иммобилиэованному на полистироле. Количество антител, сорбированных на иммобилиэованном гормоне, оценивают с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. 3 табл.

3,6 мг зеатинрибозида и 2,25 мг периодата калия растворяют в 1 мп дистиллированной воды и выдерживают при комнатной температуре. 20 мг белка растворяют в l мл дистиллированной воды и прибавляют па каплям к раствору зеатинрибоэида, рН доводят до 9,5 5 -ным раствором соды.

Добавляют 11,25 мг и смесь оставляют в холодильнике на 18 ч. Затем рН доводят муравьиной кислотой до 5,5 и оставляют смесь на 1 ч, после чего раствором аммиака доводят рН до 8,5.

Антисыворотку к зеатину получают путем введения кроликами внутримышечно

1i";,.4065r1! ) Г

Я! 1

1 мг ко}!ъюгата:)еаг!1}!а,. белком . 0,5 мл полного адьюванта ФреЙнда. Повторные

ИММУНИЗВЦ!г)И C ИНТВРВВЛОМ В ДВ6 НЕДЕЛИ

ПРОВОДЯТ В ТВЧ8ние TP6)< МВСЯЦЕВ Тем )1<6 !

0,5 мл непonHQI-о адъ!ОВ IHTB ФРИЙнда. Че" р83 неделю после по< .-леднВЙ имм)!Hè3aö)4}4 сооиоают }! каждого кролика по 20 мл крО ви. итры антисывороток 1!10000 по резуль-! ЭТам. 1..!ЦВНКа 1),ЫТОК!4!":И НОВОЙ аКТИВНОС !!4

Тзерво<})(язн},1},1 }4 4Ы}/Нофермент}4;::!М 61-1а/1ИЗОМ (ТФ 1)1<рА, 1.

ИССЛВД!/ЮТ РЯД 86Ществ с)азЛI4iIHQé ПОИРОДЫ, СРВД1»1 КОТOPb!; < V366CTHb}6 LI!4TOI<14HI4НОП Од»}бд! ! р с!!- !Л я«г!".; 1 1 ро! ° «»а КО}!)

Зеатин}}ибсз}Л„*1с} И!!11 1)- )ензиламинопурИНриооз!л»да ЬА! Ipибoзида) с Ова)11 Оу}хином

pa3BoДЯт в 0,05 Ь! натр}:}Йкарбонат)-Ом буфе08 рн ",;,7i разлива!От В:a)

ТВЧВНИ6 I 5 " сс!)}1 ! . !< НС!г!б14/! 4 с!ци}я!)

При атом г)роисходит сорбц}4Я ко;b}G!ированного гормона la г.олистироловый планшет. ГIcc/ie г!ромывки лунок фи3141)ло8С <1}М !гас-}.воопм Cgpe!"I<.iIGL}}14!«I 0,05о/

Твина-20. Раз/1иг "i}gò В лунк!4 сь}БОротк}г, ()6366 !16 1Н}/1!) В }}4 же GRr !"В<)ОО CQДВП)каI,6M 0r, ) /, ОЕВЛЬбу} "!Гл!.i-&:-. .B })яд. ЛУНQ)< добавЛя}ОТ ПО 10 }сЯКЛ и:!сс!}с!ря 11!. }!1с!..", B paw ЛИ!1! !4

П!О}4ООДЫ: 3<4с)ТИНП}4боз}ИД! КИНВТИН, ан!ИЛ!4Н<)П}/ОИ}-I ВД61.114Н, ДИ 14BOO3861 MH Изопен "8ниладе}-,ин, бензи/!)ар!8ниH, 1<141-18тии, зеатин, аденоз},-1; / .}}К. ,Цопчст4мый диапазон концентраций р6 ГУЛЯТ! О р!)В p

370С, ПОСЛВ Г}р!3,": !.1ВК}1 Добавлс;IGT Д!ИагиоСТИЧ8 Кие BНТИТВЛс);G= ПИВ Им!4!/1}О! ЛОЬУЛИН О В КРОЛ !4 К/) /4!.)Ч61.1 Ы 8 O6 }i, O i<СИ/}») ЗО!Й разведенные в фи :Иолог}«,есксч4 рañ -I)ope, Содс)ржа гц}<)}г} }0,0}5, :. 64HB-» ! :n },1,5 "/ ОВВЛЬб} <и!Ин»3 } Ф 1 О), Ioci}8 Г}ро}4ы В к} i

Ортофенилендиами;!а B 0,06 }}/1 Фосфатном буФЕРЕ QH 5 8 В Г!8::,} !!: се ГЕ с}6Г.1 ПОЯВЛЯЕТСЯ окраска, Через ЭО мин реакци}О Оста}гевлиВают Дсбавлением A.! мл 4 и с6рНо!1 кислоть). Интенсив}<ость Окраск}4 измеряют на спектра<1)отометре пр!4 492 нм.

По)ЛОВ!с 1!и г! }1унк};, }) I

ЛЯЮТ Ве}!18ства СПВБНИВа}от С ПОГЛОШВНИем

В Л У Н К а Х, ""! Д а I< OO «4 8 1 - 1 Г8 " Н И !Г ГО Н с!

I дОбавляioT ia kocTQBepHQ6 инГибирОВани8

С В Я 3 Ы В а Н И Я (!4 M M }/ !4 G p 8 а I<Т 14 B H O C T b) }) p Vi H )4 маLGT сни!ж8ние Оптической плотности 60 лее чем на 20,а 1}О сравке!1и}О с контролем.

Биотест на цитокининовую актив!ость.

Семена щирицы Amaraotus caudatus L, Оаскладывают на смоченную водой фильтровальную бумагу в чашки Петри и проращиваат в течение 72 ч в термостате в темноте при 24 С, Затем на рассеянном свету у проростков отделяют корешки и раскладывают на 10 шт. в чашки Петри диаметром

6 см на фильтровальную бумагу, смоченную

2 мл 1/75 M фосфатного буфера (pH 6,3), содержащего 1 мг/мл тирозинг и вещестВа, исследуемогс на цитокининовую активность (10 мг/л). Чашки инкубируют в темноте при 24 С. После 18 ч инкубации амарантин зкстрагируют 0,1 í HCI (2мл) Концентрацию амарантина определяют спектрофотометрически при 540 нм, Значение зкстинкции контроля (без исследуемовещества) принимают за 100 /(. Увеличение зкстинкции раствора более,чем на 20 j, по сравнени!о с контролем свидетельствует О цитокининовой активности исследуемого вещества.

В табл. 1 пока.-". Вно определение цитокининовой активнос; и соединений.

Как видно из табл. 1 цитокининоподобные Вещества проявляют иммунореактивность, а не Обладающие цитокининовой активностью — нет. Таким образом, с помощь}О ТФ}1ФА можно отбирать вещества с гормоноподобной активностьк) по их иммунореактивности в отношении специфической сыворотки к гормону (в данном г}римере к цитокинину зеатину).

Пример 2, Получение коньюгата индолилуксусной кислоты (ИУК) с белком.

Растворяют 50 мг ИУК B 1 мл безйодного д}иоксана, добавляют 50 мг дициклогексил карбодимида, раствор встряхивают в течение ЗО мин при комнатной температуре, затем по каплям, перемешивая, добавляют к

10 мл 0,1 11/1 боратного буфера рН 8,5, содержащего 100 мг белка. Раствор оставляют на ночь в холодильнике, затем очищают от несвязавшегося NYI(диализом против 0,01 М боратного буфера рН 8,0, Антисыворотку получают так же, как и для цитокининов.

Оценка ауксиновой активности в

ТФИФА...

Условия проведения анализа те же, что и в примере 1, Отличие заключается лишь в том, что сенсибилизацию проводят коньюгатом ИУК с овальбумином и используют соо ветствующие антитела к ИУК.,Среди

Веществ, которые подвергнуты анализу, в отличие от примера 1 взято больше ауксинподобных Веществ (известные ауксинподобные гербициды).

Биотест на ауксиновую активность, 1640654

10 бации растворов 18 — 20 ч. Затем каждый 15

Как видно из табл. 2 ауксиноподобные 25 вещества реагируют с сывороткой к ИУК, а не обладающие ауксиновой активностью, Семена пшеницы Альбидум 43 замачивают в воде на 18 — 24 ч (при 24 С в термостате), затем раскладывают на фильтровальной бумаге, обильно смоченной водой. Кюветы сверху закрывают стеклами и помещают в термостат при 25 С на двое суток, Иэ трехдневных колеоптилей пшеницы выбирают колеоптили оптимальной длины 18 — 20 мм или 20 — 22 мм. Из отборных колеоптилей вырезается средняя часть. После удаления первого настоящего листа отрезки колеоптилей нанизывают по 10 шт. на тонкие стеклянные спицы и помещают в исследуемые растворы (1 0 мг/л). Период инкуотрезок колеоптилией в отдельности промеряют на миллиметровой бумаге и вычисляют среднюю величину отрезка. Увеличение длины отрезков более, чем на 20 по сравнению с контролем, свидетельствует об ауксиновой активности исследуемого вещества.

8 табл. 2 показано определение ауксиновой активности соединений. не реагируют. Иэ примера 2 видно, что по. иммунореактивности вещества (т.е. по способности его реагировать с сывороткой) можно отбирать ауксинподобные вещества.

Пример 3. Исследование способности веществ, отобранных с помощью антисыворопе к зеатину в ТФИФА, повышать выживаемость растений после подсушивания (тест на засухоустойчивость).

Биологические испытания проводят на растених пшеницы сорта Симбирка (среднеустойчивого к засухе}. Семена в течение трех часов замачивают в растворе исследуемого вещества в концентрациях 0; 0,1; 1 и

10 мг/л. В качестве контроля берут вещества, не способные реагировать с антисывороткой к зеатину.

Затем семена раскладывают на стекло, покрытое фильтровальной бумагой, и помещают в кюветы с дистиллированной водой, проращивают в термостате при 24 С. Через трое суток кюветы с растениями переносят на светоплощадку. На седьмые сутки после начала проращивания отбирают по 50 одинаковых проростков каждого варианта, отделяют зерновки. и осторожно отрезают

50 корни с тем, чтобы не повредить меристематическую ткань. Затем проростки подсушивают в термостате при 24 С, пока потеря от исходной массы растений не составляет около 70 . После этого растения раскладывают на фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой, в кюветы, покрытые стеклом, выдерживают на свету в течение семи суток, К концу этого срока подсчитывают количество выживших растений (регенерировавших корневую систему).

Результаты испытания веществ на зеатиновую активность представлены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что эамачивание семян в растворах веществ, способных реагировать с антителами к зеатину, приводит к увеличению количества растений, выживших после подсушивания. Таким образом, вещества, отобранные с помощью антисыворотки к цитокинину зеатину (подобно другим веществам, обладающим цитокининовой активностью), повышают устойчивость растений к засухе. Результаты опыта свидетельствуют о том, что предлагаемый способ отбора позволяет обнаружить вещества. кбторые могут найти применение как регуляторы засухоустойчивости, Способ отличается надежностью, позволяет с достаточной легкостью анализировать одновременно десятки образцов, отличается небольшой трудоемкостью и длительностью, время проведения отбора сокращается с нескольких суток до половины рабочего дня, Формула изобретения

Способ отбора регуляторов роста растений цитокининовой и ауксиновой природы, включающий контактирование испытуемых соединений с сайтами рецепции гормонов и последующую оценку по активности взаимодействия, отличающийся тем, что, с целью упрощения и увеличения производительности процесса отбора, в качестве сайтов рецепции цитокининов и ауксинов используют соответственно специфические антитела, полученные при иммунизации животных конъюгатами зеатина и индЬлилуксусной кислоты с белком, а оценку проводят твердофазным иммуноферментным методом.

1640664

Таблица 1

Производные аденина

Таблица 2

Иммунореактивность по реакции с сывооткой к ИУК

Ауксиновая активность в биотестах

Испытуемые вещества

Индолилуксусная кислота

2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота

2-Метокси-3,6-дихлорбензойная кислота (банвел Д)

3-Метил-4-хлорфеноксиуксуснвя кислота

2-Метил-4-хлорфеноксимасля ная кислота

Абсцизовая кислота

Зеатин

Аденин.

Индолилмасляная кислота

Индолилкарбоновая кислота

Фенилуксусная кислота

На тил кс сная кислота

Таблица 3

3 ватин

3 ватин рибозид

6-,бензиламинопурин

Изопентениладенин

Кинетин

Аденин

Аденозин

Анозинфосфат

Аденозинциклофосфат

Аденозиндифосфат

Абсцизовая кислота

Индолилуксусная кислота

Иммунареактивность Цитокининовая акпо реакции с сыво- тивность в биотестах роткой к зеатинрибози