Способ определения молекулярной массы белков

 

Изобретение относится к физико-химической биологии и биотехнологии и позволяет быстро и экономично в лабораторных условиях получать смесь полипептидов для определения молекулярной массы белков. Целью изобретения является упрощение анализа, снижение затрат и расширение возможности применения. Для определения молекулярной массы белка используют гетерогенный белок из эндосперма кукурузы, экстрагируемый 65 - 75% этанолом с 1,5 - 2,5 М мочевины при нагреве. При этом в полученном препарате содержится специфичный набор компонентов, легко идентифицируемых в полиакриламидном геле после электрофореза, с помощью которого определяют молекулярную массу неизвестных белков в диапазоне 17000 - 480000 Д. 1 ил. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4735579/13 (22) 14.07.89 (46) 07.07.91, Бюл. М 25 (71) Казахский научно-исследовательский институт земледелия им. В.Р,Вильямса (72) И.M,Ñàâè÷ (53) 631.516.89(088.8) (56) Патен ГДР М 188091, кл. G 01 14 27/27, 1976. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ (57) Изобретение относится к физико-химической биологии и биотехнологии и позволяет быстро и экономично в лабораторных условиях получать смесь полипептидов для

Изобретение относится к физико-химической биологии и биотехнологии, а именно к биологической химии, и может быть использовано научно-исследовательскими учреждениями при изучении свойств, структуры и функции белков.

Целью изобретения является упрощение анализа, снижение затрат и расширение возможности применения.

Способ состоит в том, что используют гетерогенный белок, который получают из эндосперма одноразовой кукурузы экстра кцией раствором спиртовой мочевины. При этом экстракт включает набор полипептидов, которые после электрофореза с додецилсульфатом натрия (ДДС вЂ” Na) образуют характерный, легко идентифицируемый электрофоретический спектр компонентов с известными молекулярными массами, что позволяет использовать их в качестве стан. дартных белков-маркеров для определения молекулярной массы неизвестных белков... Ы,„, 1661639 А1 (5П5 G 01 N 27/26 С 07 К 3/02 определения молекулярной массы белков, Целью изобретения является упрощение анализа, снижение затрат и расширение возможности применения. Для определения молекулярной массы белка используют гетерогенный белок из эндосперма кукурузы. экстрагируемый 65 — 75 этанолом с 1,5—

2,5 М мочевины при нагреве. При этом в полученном препарате содержится специфичный набор компонентов, легко идентифицируемых в полиакриламидном геле после электрофореза, с помощью которого определяют молекулярную массу неизвестных белков в диапазоне 17000 — 480000 Д, 1 ил. 1 табл.

Пример 1. Зерна кукурузы освобождают от зародыша и размалывают до тонкого порошка, отвешивают 100 мг муки в пробирку, приливают 1 мл 70%-ного этано- О ла с 2М мочевины, перемешивают и остав- О ляют при комнатной температуре на 0,5 ч, а затем помещают на 1 ч на водяную баню при Ос, . 60 С. После этого смесь центрифугируют (1 при 7000 g в течение 15 мин, супернатант ) сливают, упаривают до 1/4 — 1/5 объема и используют в качестве набора полипептидов с известными молекулярными массами;

Для проведения электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с ДДС-Na используют 5 -ный концентрирующий гель и

12,5 -ный разделяющий, Перед электрофорезом белковый препарат смешивают с равным объемом буфера, содержащего 0,125 М трис-MCI (рН 6.8), 4 ДДС вЂ” Na, 20 глицерина, 0,002 бромфенолового синего, и наносят на одну иэ дорожек ПААГ, на остальные наносят неизвестные белковые препараты.

1661639

В данном случае используют глобулины из зерен пшеницы, кукурузы, сорго и риса.

Злектрофорез в пластинчатом геле (120 х

120) толщиной 1 мм ведут при постоянном напряжении 10G В до тех пор, пока бромфеноловый синий не достигает конца геля. По окончании электрофореза гель фиксируют в

10;4-ном pBGTBope трихлоруксусной кислО ты в течение 1 ч, окрашивают 0,05 — ным раствором красителя кумасси R-250 в течение

2 ч и отмывают от избытка красителя 107ьным этанолом с 5 g,— Hoé уксусной кислотой.

Полипептиды эндосперма кукурузы об разуют весьма характерную картину независимо от образца кукурузы. При исследовании более 40 самоопыленных линий кукурузы возможно и в каждом случае легко идентлфицировать маркерные полипептиды, Имеющиеся у кукурузы мобильные элементы кодируют совершенно другие белки и никакого отношения к зеиновым белкам не имеют, Напротив, зеин кукурузы является крайне консервативным белком..

Для расчета молекулярной массы неизвестных белков строят калибровочную кривую. По горизонтали откладывают расстояние от старта до конечного маркерного полипептида, а по вертикали логарифмы (I n) молекулярных масс данных компонентов (см, чертеж), По данной кривой находят молекулярную массу неизвестных белков в интервале17000 — 480000Д, так как за пределами этих значений в эндосперме кукурузы просто нет белков.

Для определения молекулярной массы глобулинов измеряют расстояние от старта до всех неизвестных полипептидов глобулинов пшеницы, кукурузы, сорго и риса. Каждую цифру откладывают по оси абсцисс, проводят перпендикуляр до соединения с калибровочной кривой и от данной точки прбводят перпендикуляр до оси ординат.

По полученным цифрам находят в таблице мантисс десятичных логарифмов значения, которые соответствуют молекулярным массам неизвестных полипептидов, В таблице приведены молекулярные массы полипептидов глобулинов четырех названных культур, рассчитанных по предложенному способу, Пример ". Зерно кукурузы освобождают от зародыша и размалывают до тонкого .порошка, отвешивают 100 мг муки, в пробирку приливают 1 мл 65 j,-ного этанола с 1,5 М ммооччееввиинныы,, ппееррееммеешивают и оставляют при комнатной температуре на 0,5 ч, а затем помещают на 1 ч на водяную баню при

60 С. Остальная процедура по проведению

5 электрофореза и определению молекулярной массы неизвестного белка совпадает с описанной в примере 1. Количество полипептидов зеина и их распределение по молекулярной массе совпадает с таковыми при

10 использовании зкстракции с помощью 70 Дного этанола с 2М мочевины, Пример 3. К 100 мг тонко размолотого эндосперма кукурузы приливают t мл 75 /ного этанола, содержащего 2,5 M мочевины, 15 Остальная процедура по экстракции белка, электрофорезу и определению молекулярной массы неизвестного белка совпадает с описанной в примере -1, Количество полипептидов и их распределение по молеку20 лярной массе одинаково зеиновым белкам, полученным с помощью 70 j -ного этанола с

2 M мочевины.

Таким образом, для осуществления способа необходимо извлечь из эндосперма ку25 курузы зеин с помощью 65 — 75 -ного этанола, содержащем 1,5-2,5 M мочевины, in использовать их в качестве набора полипептидов с известными молекулярными массами.

30 Предлагаемый способ определения молекулярной массы неизвестных белков имеет следующие преимущества: использование маркерных полипептидов из эндосперма кукурузы упрощает и снижает затраты, позволя35 ет легко и быстро без дополнительной очистки получить требуемый набор полипептидов в любом количестве в лабораторных условиях и определять молекулярную массу в широком диапазоне 17000 — 480000 Д.

Формула изобретения

Способ определения молекулярной массы белков, включающий сравнение исс45 ледуемого белка с набором маркерных полипептидов с известной молекулярной массой, отличающийся тем, что, с целью упрощения анализа. снижения затрат и расширения возможностей применения, в ка50 честве набора маркерных полипептидов используют зеиновый спектр кукурузы, полученный в результате электрофоретического разделения белков, экстрагируемых

65 — 75 $-ным этанолом с 1,5 — 2,5 M мочевины

55 при нагревании.

1661639

Молекулярные массы полипептидов (КД) глобулинов зерна пшеницы, кукурузы, сорго и риса, вычисленные по распределению в ПААГ полипептидов спирторастворимого белка кукурузы

6 ы

) 58

Д с

Л 30 40 50 ба 70 8d

Расстояние от сеарща, ww

Составитель В.Демкин

Редактор М.Стрельникова Техред М.Моргентал Корректор О.Кравцова

Заказ 2119 Тираж 401 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101