Способ раздельного получения бесклеточных экстрактов листьев папортника и цианобактерий из симбиотической системы azolla-аnаваеnа azolla

 

Изобретение относится к биохимии растений, в частности к физико-химическим методам получения и анализа растительных белков, и может быть использовано в работах по изучению обмена веществ в симбиотической системе азолла - анабена, которые призваны обеспечить ускоренное внедрение этой перспективной культуры в народнохозяйственную практику. Целью изобретения является улучшение качества разделения и повышение выхода растворимых белков папоротника и цианобактерий. Основу предложенного способа составляет новая совокупность методических приемов, относящихся к режимам гомогенизации и фракционирования растительного материала. Способ предусматривает 6 основных стадий: 1) гомогенизацию листьев в фарфоровой ступке (12-15 мин при соотношении с буферным раствором 1:(2-5), 2)фильтрование гомогената, 3) низкоскоростное центрифугирование фильтрата (с микроскопическим контролем или при установленном на основании его результатов режиме- 2 мин при 1000G), 4) промывание осадка клеток центрифугированием в тех же условиях, 5) растирание клеток цианобактерий с кварцевым песком в фарфоровой ступке (12-15 мин при соотношении с буферным раствором 0,1:(8-10), 6) высокоскоростное центрифугирование гомогената цианобактерий и супернатанта после первого низкоскоростного центрифугирования. При точном соблюдении разработанных режимов новый метод обеспечивает получение из 5 г исходного материала 70 мг растворимых белков папоротника и 7 мг растворимых белков водоросли, характеризующихся высокими уровнями нативности и чистоты.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4439402/31 — 13. (?2) 23.05.88 (46) 23.12.90. Бюл. ¹ 47 (71) Институт биохимии им. A.H.Áàõà (72) Н,Г,Русинова (SV) и Ле Тхи Лан

Оань (VN) (53) 577.1 (088.8) (56) Колесников П,А,, Зорэ С.В. Физиология растений, 1986, т. 33, № 1, с. 82-86. (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЬНОГО ПОЛУЧЕНИЯ

БЕСКЛЕТОЧНЪ|Х ЭКСТРАКТОВ ЛИСТЬЕВ IIAПОРОТНИКА И ЦИАНОБАКТЕРИЙ ИЗ СИМБИОТИЧЕСКОИ СИСТЕМЫ AZOLLA ANABAFNA

AZ0LLA (57) Изобретение относится к биохимии растений, в частности к физикохимическим методам получения и анализа растительных белков, и может быть использовано в работах по изучению обмена веществ в симбиотической системе азолла — анабена, которые признаны обеспечить ускоренное внедрение этой перспективной культуры в народнохозяйственную практику. Целью изобретения является улучшение качества разделения и повышение выхода растворимых белков папоротника и цианобактерий. Основу предложенного способа составляет новая совокупИзобретение относится к биохимии растений, в частности к физико-химическим методам получения и анализа растительных белков, и может быть использовано в работах научного и прикладного характера, направленных 1 на.изучение общего обмена веществ в

„.80„„1615174 А 1 (51) 5 С 12 N 1/12 С 07 К 3/12 ность методических приемов, относящихся к режимам гомогениэации и фракционирования растительного материала. Способ предусматривает 6 основных стадий: 1) гомогенизацию листьев в фарфоровой ступке (12-15 мин при соотношении с буферным раствором 1:(2-5)), 2) фильтрование гомогената, 3) низкоскоростное центрифугирование фильтрата (с микроскопическим контролем или при установленном на основании его результатов ре— жиме — 2 мин при 1000 g), 4} промывание осадка клеток. центрифугированием в тех же условиях, 5) растирание клеток цианобактерий с кварцевым песком в фарфоровой ступке (12

15 мин при соотношении с буферным раствором О,1:(8-10)), 6) высокоскоростное центрифугирование гомогената цианобактерий и супернатанта после первого низкоскоростного центрифугирования. При точном соблюдении разработанных режимов новый метод обеспечивает получение из 5 г исходного материала 70 мг растворимых белков папоротника и 7 мг растворимых белков водоросли, характеризующихся высокими уровнями нативности и чистоты. симбиотической системе азолла ана— бена и обеспечение, более быстрого внедрения этой системы в народнохозяйственную практику (в качестве удобрения для рисовых полей, сырья для попучения биогаза, корма для домашних животных).

1615174

Целью изобретения является улуч—

1 жение качества разделения и повы— шение выхода растворимых белков папоротника и цианобактерий, Основу предлагаемого способа составляет новая совокупность методических приемов, относящихся преимущественно к режимам гомогенизации ! и фракционирования растительного ма териала и направленных на устранение условий, которые приводят к взаимноу загрязнению двух типов получаемых белков, и обеспечение наиболее полной экстракции растворимых веществ бел,ковой природы.

Способ предусматривает 6 основных стадий: гомогенизацию листьев в .,фарфоровой ступке, фильтрование го могената низкосортное центрифугироI вание фильтрата, промывание клеток цианобактерий (осадок) центрифугир о,ванием, растирание кпеток цианобак— терий с песком в фарфоровой ступке, а также высокоскоростное центрифугирование гомогената цианобактерий и супернатанта после первого центрифугирования фильтрата листьев папоротника.

При точном соблюдении предлагаемых режимов гомогенизации и разделения новый метод обеспечивает получение из 5 г исходного материала

70 мг растворимого белка азоллы и 7 мг растворимогб белка анабены, отличающихся высоким уровнем нативности и чистоты разделения, которые контролируют электрофоретически и по активности рибулозодифосфаткарбоксилазы. Время анализа примерно 2 ч„

Пример 1. Выращивание трех видов азоллы (A, pinnata, А,filliсuloides, А.caroliniana) проводят в оранжерее под люминесцентными лампами при 25000 люкс в плоских кюветах (эмалированных), заполненных питательной средой Таллея, не содержащей связанного азота, Питательную среду меняют через три дня. Для опы— тов используют 7-дневные культуры азоллы, которые содержат в основном вегетативные клетки цианобактерий.

Состав среды, мМ: СаСl < 0,8; КН ".04. ,0,2; K2SOy 0,5; MgSOg 0,5; NaC1 0,1;

НЗВО 1; СоС1 1; CuSOg О, 1; железо в виде этилендиаминтетраацетатного комплекса 50, NagMoSOq 0,2 мкМ;

ZnS0 0,2 мкМ.

Получение гомогената листьев папоротника А, pinnata. 5 r азоллы без корней (кор ни удаляют ножницами) рас5 тирают при 0-4 С в фарфоровой ступке в течение 15 мин в присутствии 10 мл раствора А: 0,05 М трис-НС1 буфер9 рН 8,5, содержащий 0,2 M хлористый натрий, 0,0005 M этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), 0,01 M дитиотреитол, 0,01 M хлористый магний, 27-ный поливинилпирролидон. Полученный гомогенат фильтруют через 8 слоев марли с ватой. Фильтрат центрифугируют

2 мин при 1000g.

Получение бесклеточного экстракта листьев папоротника, Надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования фильтрата, подвергают высокоскоростному центрифугированию (30 мин при 23000 g). Полученный надосадочный раствор (бесклеточный экстракт) содержит растворимые белки листьев папоротника (70 мг), Для доказательства нативности белка используют тест на активность рибулозодифосфаткарбоксилазы (КФ 4.1.1.39)фермента, который составляет около 507о от растворимых белков листьев растений. Исследованная в бесклеточном экстракте удельная активность этого фермента 0,23 ед/мг белка и сравнима с известной для других растений.

Получение клеток цианобактерий.

Осадок, полученный после центрифугирования фильтрата при 1000 g в течение 2 мин, четыре раза промывают раствором А путем цент ифугирования при 1000 g в течение 2 мин. Промытый осадок представляет собой клетки цианобактерии (50 мг). Осадок суспендируют в 5 мл раствора А, Получение бесклеточного экстракта цианобактерии. Суспензию цианобактерий растирают в фарфоровой ступке в течение 15 мин в присутствии мелкого .бесцветного кварцевого песка с размером песчинок 0,2-0,5 мм.

Гомогенат центрифугируют 30 мин при

23000 g, Надосадочный раствор (бесклеточный экстракт), содержащий 7 мг растворимых белков, имеет характерный для цианобактерий .сине-зеленый цвет, Для доказательства нативности .55 белка используют тест на активность рибулозодифосфаткарбоксилазы, Величина удельной активности рибулозодифосфаткарбоксилазы, опр.еделенная в 1615174

Ф о р м у,л а и э о б р е т е н и я

Составитель О.Скуратовская

Редактор Н.Гунько Техред Л.Сердюкова Корректор М.Самборская

Заказ 396 1 Тираж 491 Подписное, ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул. Гагарина, 101 бесклеточном экстракте симбиотической цианобактерии, 0,35 ед/мг белка и оказалась одного порядка с величиной удельной активности этого фермента из клеток свободноживущих цианобактерий.

П р им е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1,однако растирание листьев папоротника в фарфоровой ступке. ведут менее 12 мин (10 мин), что приводит к снижению выхода растворимых белков листьев папоротника до 50 м . а также к снижению содержания растворимых белков цианобактерий до 5,0 мг.

Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, однако растирание листьев в фарфоровой ступке ведут более 15 мин (20 мин), что не приводит к дальнейшему повьппению выхода растворимых белков листьев папоротника и клеток цианобактерий, При растирании клеток цианобактерий с песком более 15 мин повышения выхода растворимых белков также не наблюдается, поэтому повышение времени растирания нецелесообразно.

Пример 4, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но при соотношении листьев папоротника и буферного раствора (вес/объем) 1:5, Результаты аналогичны полученным в примере 1.

Пример 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но при весовом соотношении клеток цианобактерий и буферного раствора (вес/

/объем) О,1:8. Результаты аналогичны полученным в примере 1, Пример 6. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но используют листья папоротника Azolla

caroliniana Результаты аналогичны полученным в примере 1, Пример 7. Способ осуществляют согласно примеру 1, но используют листья папоротника Azolla filiculoides Результаты аналогичны полученным в примере 1, 6

Таким образом, при точном соблюдении разработанных режимов предлагаемый способ позволяет обеспечить качественное разделение растворимых

5 белков папоротника и цианобактерии иэ симбиогической системы Azolla

Anabaena azulla, а также повысить выход целевого продукта как за счет полн ты разделения тканей папоротника и цианобактерий, так и благодаря созданию условий для максимальных уровней экстракции белковых веществ.

Использование изобретения способствует развитию научных и приклацных работ, направленных на внедрение новой весьма перспективной сельскохозяйственной культуры, Споссб раздельного получения бесклеточных экстрактов листьев папоротника и цианобактерий из симбиотической системы Azolla-АпаЪаепа azolla, включающий гомогениэацию растиранием в фарфоровой ступке растительного материала в буферном растворе, фильтрование гомогената, отделение клеток цианобактерий при помощи низкоскоростного центрифугирования с контролем результата осаждения, разрушение клеток цианобактерий с последующим центрифугированием гомогената, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества разделения и повьппения выхода растворимых белков, гомогенизацию листьев и цианобактерий ведут в течение 12-15 мин, разрушение осажденных клеток цианобактерий осуществляют путем растирания в ступке с кварцевым песком в бу45 ферном растворе при соотношении масса/

/объем 0,1:8-10, а гомогенат цианобактерий и полученный после низкосортного центрифугирования супернатант подвергают для удаления нераст" воримой фракции центрифугированию,