Способ получения кднк-клонов, кодирующих человеческий эритропоэтин

 

Изобретение касается клонированных генов для человеческого эритропоэтина, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов и получения INOITRO активного человеческого эритропоэтина (ЭПО). Целью изобретения является повышение точности способа и повышение выхода эритропоэтина. Способ получения клонов предлагает отбор клонов в результате гибридизации Л кДНК - библиотеки фага м РНК фетальной печени с олигонуклеотидными зондами, которые получают путем выделения и очистки эритропоэтина из человеческой мочи, страдающих пластической анемией, с последующим анализом аминокислотных последовательностей трипсиновых фрагментов.

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„. Я0„„167293 (ц) С 12 N 15/12

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К FlATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (86) PCr/US aS/02405 (03.12.85) (21) 4028136/13 (22) 01. 08. 86 (31) 688622 (32) 03.01.85 (33) US (46) 23.08.91. Бюл, у 31 (71) Дженетикс Институт, Инк. (US) (72) Эдвард Фритч (US), Родни М.Хьювик (GB) и Кеннет Джекобс (US) (53) 575.224.2:577.2(048)(088.8) (56) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1984, ч. 81, р. 2708-2712 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ кДН! -КЛОНОВ, КОДИРУЮЩИХ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ЭРИТРОПОЭТ1Ш (57) Изобретение касается клонированных генов для человеческого эритроИзобретение касается клонированных генов для человеческого эритропоэтина, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов и получение in vitro активного человеческого эритропоэтина (ЭПО).

Целью изобретения является повышение точности способа и повышение выхода эритропоэтина при экспрессии в животных клетках.

Способ заключается в том, что осуществляют отбор клонов в результате гибридизации ) кДНК-библиотеки фага мРНК фетальной печени с олигонуклеотидными зондами, которые получают путем выделения и очистки эритропоэтина иэ мочи людей, страдающих апластической анелей с последующим анализом аминокислотных последовательностей трипсиновых фрагментов.

2 поэтика, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии укаэанных генов и получения in vitro активного человеческого эритропоэтина (ЭПО), Целью изобретения является повышение точности способа и повышение выхода эритропоэтина. Способ получения клонов предлагает отбор клонов в результате гибридизации ЪкДНК вЂ” библиотеки фага мРНК фетальной печени с олигонуклеотидными зондами, которые получают путем выделения и очистки эритропоэти на из мочи людей, страдающих апластичеСкой анемией, с последующим анализом аминокислотных последовательностей трипсиновых фрагментов.

Пример 1. Выделение геномного клона ЭПО.

ЭПО очищают от мочи пациентов, страдающих анемией, известным способом за исключением того, что фенольную обработку заменяют термообработо кой при 80 С в течение 5 мин для инактивации нейраминидазы. Конечной стадией очистки является фракционирование на колонке высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием 0-95Х ацетонитрильного градиента с 0,13-ной трифторуксусной е кислотой (ТФК) в течение 100 мин, Положение ЭПО в градиенте определяют (J4 электрофорезом в геле и анализом Nконцевой последовательности основных пиков. ЭПО элюируют при 53Х ацетонитрила и подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращен1672930 ной фазой, Фракции, содержащие ЭПО, выпаривают до 100 мкл, доводят до рН 7,0 бикарбонатом аммония, переваривают 27-ным TPCK-обработанным трипо

5 сином в течение 18 ч при 37 С, затем подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой.

Записывают оптическую плотность при

280 и 214 нм. Разделенные пики выпаривают почти досуха и подвергают не- 10 посредственно анализу N-концевой аминокислотной последовательности, используя газофазный секвениатор. Два фрагмента иэ трипсинового гидролизата отбирают для синтеза олигонуклеотид ных зондов. Иэ последовательности

Val-Asn-Phe-Tyr-Аlа-Trp-Lys (аминокислоты 46-52) получают 17-мер

А А А

TTCCANGCGTAGAAGTT

20 и 18-мер

А А А

CCANGCGTAGTAG GAAGTTNAC

Иэ последовательности Ual-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (аминокислоты 144150) получают два пула 14-меров

TTGN Т Т TTGN Т

ТАСАСТААСТТССТ и ТАСАССТААСТТСТТ 30 которые отличаются в первом положении лейцинового Кп«а

Олигонуклеотиды 5 -конец метят по

32 р, Используя полинуклеотидную кина- 35 зу и гамма Р-АТР. Геномную кДНКбиблиотеку человека, клонированную в ф бактериофаге, подвергают скринингу. Приблизительно 3,5 х 10 фага вы5 севают с плотностью 6000 фага на

150 мм чашку Петри (среды NZCYM) и о инкубируют при 37 С до тех пор, пока пятна не станут видимыми (размером около 0,5 мм). После охлаждения при

4 С в течение 1 ч реплики пятен пере- 45 о носят на нейлоновые мембраны и инкубируют в течение ночи при 37 С на чашках со свежими средами. Затем фильтры денатурируют и нейтрализуют. После вакуумной сушки при 80 С в тече.ние 2 ч фильтры промывают в 5 х 8$С, 0,5X SDS в течение 1 ч и клеточные остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью. Это соскабливание снижает фоновое связывание зонда с фильтрами.

Фильтры затем промывают водой и предварительно гибридизируют 4-8 ч при

48 С в 3М растворе тетраметиламмонийхлорида, 10 мМ Ма РЛ4., PH 6,8

Х раствор Денхарда, 0,5X SDS и 10 мИ

ЭДТА, 17-мер, меченный Р, прибавляют в концентрации О, 1 пмоль/мл и гибридизируют при ° 48 C в течение 72 ч. После гибридизации фильтры промывают

2 х SSC, 0,3 М NaCl 0,03 М цитрат натрия, рН 7,0 при комнатной температуре, затем в течение 1 ч в 3М

ТИАС1-10 мМ Na POy, рН 6,8 при комнатной температуре и 5-15 мин при температуре гибридизации. Приблизительно 120 сильных сигналов обнаруживают после 2-дневной авторадиографии. Эти клоны группируют в пулы по 8, пересеивают и вновь подвергают скринингу в трипликате.

Пример 2, Анализ мРНК человеческой фетальной печени, I

По 5 мкг мРНК человеческой фетальной печени н мРНК печени взрослого подвергают злектрофорезу в 0,87-ном агарозном формальдегидном геле и переносят на нитроцеллюлозу. Однонитевый зонд затем получают иэ матрицы

М13. Праймером является 20-мер, происходящий иэ того же триптического фрагмента, что и первоначальный 17-мерзонд. Зонд получают известным способом, однако вслед за отщеплением

Smal (который продуцирует желательный зонд длиной 95 п.о., содержащий

74 п.о. кодирующей последовательности) малый фрагмент очищают от матрицы М13 хроматографией на колонке с се фазорой С14В. Фильтр гибридизируют приблизительно до 5 х 10 отсчетов в

1 мин этого зонда в течение 12 ч при

68 С, промывают в двух SSC при 68 Си подвергают воздействию в течение

6 дней усиливающего экрана. Фиксируют однонитевую маркерную мРНК иэ 1200 п.о, Пример 3. кДНК фетальной печени.

Идентичный зонд получают и используют для скрининга библиотеки кДНК фетальной печени, полученной в векторе д -Ch2 1А, используя стандартные методики скрининга. Три самостоятельных положительных клона (3-HEPOF Ь Ь (1350 пар оснований); A -HEPOF L 8 (700 п.о.), ф-HEPOF L 13 (1400 п.о.)) выделяют путем скрининга 1 х 10 пятен.

Полную вставку ф-HEPOF Е 13 и Q-HEPOF

L 6 секвенируют вслед за субклонированием в М13. +-HEPOF L 8 секвенируют только часть, а оставшуюся подразумевают идентичной другим клонам.

16729 кДНК-клоны 7 -HEPOF L 6, Q-HEPOF

8 и A-HEPOF L 13 депонированы в коллекции American Type Culture Collecti on, Rockville, Maryland, под номерами

ATCC 40156, АТСС 40152 и АТСС 40153 соответственно.

Геномные клоны h-ÍEPO1, gl-ÍÅP02, ф-НЕРОЗ и %-НЕРО6 депонированы и доступны из American Type Culture Col- 10

lection, Rockville, Maryland, под входящими номерами АТСС 40154, АТСС

40155, ATCC 40150 и АТСС 40151 соответственно, Пример 4. Конструирование век-15 тора р91023(В).

Вектором трансформации является

pAdD 26 SVpA (3). Он содержит кДНКген дигидрофолятредуктаэы мьппи (DFHP), который находится под транскрипциональным контролем основного позднего промотора аденовируса 2 (Ad 2). 5

) сайт сращивания указан в аденовирусной ДНК, а 3 -сайт сращивания, происходящий от гена имиуноглобулина, присутствует между основным поздним промотором аденовируса 2 и DFHP-кодирующей последовательностью. Ранний сайт полиаденилирования SV40 присутствует по направлению ниже от DFHP- 30 кодирующей последовательности. Участок прокариотического происхождения

pAdD 26 SVpA исходит из pSVOd (Cell, 1981, 27, 279) и не содержит последовательности pBR 322, 35

pAdD 26 SVpA (3) превращают в плаэмиду pCVSV 12, padD 26 USpA (3) превращают н плазмиду pAdD 26 SVpA (3) (d) дележей одного иэ двух сайтов

Pst н плазмиде PAdD 26 SVpA (3). Это 40 осуществляют путем частичного переваривания рестриктазой Pst I так, что получают субпопуляцию линеаризованных плазмид, в которой только один сайт Pst I расщеплен. Затем об- 45 рабатывают ферментом Кленова, сшивают, скринируют для делеции сайта

Pst I, расположенного 3 к полиадениляционной последовательности SV 40.

pAdD 26 SVpA (3) (d) расщепляют

Pvu II. Затем .р?АИ 43 (Cell, 1979, 16, 851) переваривают Xho I, обрабатывают фрагментом Кленова, переваривают Рчи ЕЕ, и фрагмент из 140 п.о.

55 выделяют электрофорезом в 67-ном акриламидном геле. Этот фрагмент

140 п.о, сшивают с Pvu II — переваренной плазмидой pAdD 26 SVpA (3) (d) .

Смесью трансформируют Е. coli, отбирают по устойчивости к тетрациклину и колонии подвергают скринингу с использованием зонда, меченного по Р, эя гибридиэирующегося с фрагментои иэ

140 п.о. ДНК выделяют из положительно гибридизирующихся колоний и анализируют для отбора правильной ориен1 тации сайта Pvu II — на 5 -стороне вставки 140 п.о. Эта плаэмида обозначена pTP L

Фрагмент Ava II D вируса SV 40, содержащего последовательность энхансера SV 40, получают путем гидролиза

ДНК SV 40 рестриктаэой А а II, эатупления концов фрагментом Кленова, сшивания XhoI-линкеров с фрагментами, переваривания Xho I для открывания сайта Xho I и выделения наибольшего фрагмента (Р) посредством электрофореза в геле. Этот фрагмент затеи сшивают с pTPL по сайту Xho I, получая плазмиду рС Л YL 2-TPL. Ориентация фрагмента Dsv 40 и pCYS YL 2-ТРЬ такона, что поздний промотор вируса

SV 40 находится в такой же ориентации, что и основной поздний промотор аденовируса.

Для введения генов, связанных с аденонирусом (генов ЧА), в pCY SYL

2-TPL, вначале конструируют плазмиду

pBR 322, которая содержит фрагмент

В Hind III аденовируса типа 2. ДНК аденовируса типа 2 переваривают

Hind III и фрагмент В выделяют электрофорезом в геле. Этот фрагмент вставляют в плаэмиду pBR 322, которую предварительно расщепляют рестриктазой Hind III После трансформации

Е. coli отбирают рекомбинанты со вставкой фрагмента В Hind.III, и вставленную ориентацию определяют путеи переваривания рестрикционным ферментом, pBR 322 — Hind III В содержит фрагмент В Hind III аденовируса типа

2 в ориентации.

Гены ЧА получают иэ плазмиды

pBR 322 — Ad Hind III В путем переваривания Нра I, добавления линкеров

EcoR I и расщепления рестриктазой

EcoR I с последующим восстановлением фрагмента 1,4 кб. Фрагмент, имеющий липкие концы EcoR I, затеи встраивают по EcoR I в PTL. После трансформации НВ101 Е. со11 и отбора по устойчивости к тетрациклину колонии подвергают скринингу посредством гибри1672930 дизации с ДНК, специфичной к гену ЧА.

ДНК получают иэ положительно гибридиэирующих клонов и охарактеризовывают перевариванием рестрикционной зндону5 клеазой. Полученную ппазмиду обозначают р91023.

Два сайта EcoR I в плаэмиде р91023 отщепляют путем разрезания р91023 рестриктазой EcoR I до двух ДНК-фрагментов: 7 т.п.о. и 1 3 т.п.о. Последний фрагмент содержит гены VA. Концы обоих фрагментов застраивают с использованием фрагмента Кленова Pol 1 и два фрагмента затем сшивают. Плазмида р91023(А) содержит гены VA и яв ляется аналогичной плаэмиде р91023, беэ EcoR I - EcoR I фрагмента.

Один Pst I-сайт в плазмиде р91023(А) отщепляют и заменяют на

EcoR I-сайт. р91023(А) разрезают до готовности при помощи Pst I и обрабатывают фрагментом Кленова Pol I для генерации прорастающих концов. EcoR I-25 линкеры сшивают с тупоконечным сайтом Pst I плазмиды р91023(А). Линейную плазмиду р91023(А) с EcoR I-линкерами, присоединенньичи по затупленному сайту Pst I, переваривают до готовности EcoR I, после чего повторно сшивают. Плазмиду р91023(В) восстанавливают и идентифицируют -как структуру, аналогичную плаэмиде р91023(А), но вместо прежнего сайта

Pst I содержащую сайт EcoR 1. Плазмида p91023(B) депонирована в коллекции American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящим номером ATCC 39754.

Пример 5. кДНК-клоны (Ъ-ЕРОР

Ь 6 и $ -EPOF Ь 13 по примеру 3) встраивают в плаэмиду p91023(B), образуя pPTF Ь 6 и pPTF L 13 соответственно. 8 мкг каждой из очищенных 45

ДНК используют для трансфекции 5а10 клеток COS, используя DEAE-декстранметод. Через 12 ч клетки промывают и обрабатывают хлорохином (0,1 мМ) в течение 2 ч промывают вновь и выЭ

50 держивают в течение 24 ч в 10 мп сред, содержащих 10Х-ную фетальную телячью сыворотку. Среду меняют на

4 мп среды, свободной от сыворотки, и собирают через 48 ч.

Получение иммунологически активно55 го ЭПО определяют количественно радиоиммунным анализом. Чувствительность пробы составляет 1 нг/мл. Уровень ЭПО, высвобожденного в среду штаммом, содержащим pPTF L 13, составляет 330 нг/мл.

pPTF Ь 13 депонирована в коллекции American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящим номером АТСС 39990.

Пример 6. кДНК ЭПО ($-HEPOF

L 13) вставляют в плазмиду p91023(B), трансфекцируют в клетки COS-1 и собирают аналогично примеру 5, эа исключением того, что обработку хлорохином не проводят.

Биологически активный in vitro ЭПО измеряют с использованием либо колониеобраэующей пробы с клетками фетальной печени мыши в качестве источника

CFV-E, либо пробы поглощения .Н-тиЭ мидином, используя клетки.селезенки мышей, иньецированных фенилгидразином, Чувствительности этих анализов составляют 25 мЕд/мл. Биологически активный

1n vlvo ЭПО измеряют с использованием либо метода гипоксической мьппи, либо метода "голодающей крысы". Чувствительность этих анализов составляет

100 мЕд/мл.

ЭПО из клеток COS, трансфекцированных кДНК-клона EPOF L 13 тип I

Проба Активность

RIA 100 нг/мл

CFU-Е 2 0 5 Ед/мл

У

Н-Т1у 3,1 1,8 Ед/мл

Гипоксическая мышь 1 Ед/мл

Голодающая крыса 2 Ед/мп

Пример 7. ЭПО из клеток COS.

180 нг ЭПО, высвобожденного в среду трансфекцированными кДНК-ЭПО (Q-HEPOF Ь 13) (выше), подвергают электрофорезу в 107-ном SDS полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр, зондируют антителом анти-ЭПО, промывают и повторно зондируют I белком А. Фильтр авторадиографируют в течение двух дней.

Нативный гомогенный ЭПО, описанный в примере 1, подвергают электрофорезу перед или после йодирования. Используемые маркеры включают метионин,меченный, S, сывороточный альбумин (68000 Д) и яичный альбумин (45000 Д). !

Пример 8. Конструирование

RK1-4.

1672930

Выделяют фрагмент Bam HI-Pvu II иэ плаэмиды РЯЧ 20 НГК, содержащий ранний промотор SV 40, смежный с геном дигидрофолятредуктаэы мьппи (DHFR), энхансер SV 40,малый антигенный интрон и последовательность полиаденилирования SV 40 (фрагмент А). Остальные фрагменты получают иэ вектора р91023(А) (выше) следующим образом: р91023(А) переваривают Pst I в единственном сайте Pst 1 около промотора аденовируса и либо сшивают с синтетическими конвертерами Pst I-EcoR I H рециркулиэуют (создавая сайты Pst

EcoR I-Pst 1 в первоначальном сайте

Pst I; 91023(B )), либо обрабатывают большим фрагментом ДНК-полимераэы I для разрушения сайтов Pst I и сшивают с синтетическим EcoR I-линкером 20 и рециркулиэуют (соэдавая EcoR Iсайт в первоначальном сайте Pst I, 91023(В)). Каждую из двух полученных плазмид 91023(В) и 91023(B ) переваривают Xha EcoR I для получе- 25 ния двух фрагментов (F и С). Путем соединения фрагмента С иэ плазмиды

p91023(B) и фрагмента F из плаэмиды р91023(В ), а также фрагмента С из плазмиды р9 1023(В) и фрагмента F 3p иэ плаэмиды p91023(B ) создают две новые плаэмиды,которые содержат либо сайт EcoR I-Pst I, либо сайт

Pst I-EcoR I, где Pst I-сайт наиболее близок к основному позднему промо->5 тору аденовируса (р91023(С)) °

Вектор р91023(С) ) гидролизуют Xho I, липкие концы эатупляют с помощью ДНКполимеразы I, пришивают фрагмент

Hind ?II-EcoR I размером 340 п.о,, содержащий энхансер SV 40. Вектор с

lac получают перевариванием ДНК с

lac рестриктазой Bam HI, заполнением липкого конца фрагментом ДНК-полиме45 разы I и перевариванием рестриктаэой

Hind III. Полученную плазмиду (cSVHPlac) регенерируют по Ваш Н?сайту путем сшивания с тупым концом

Pvu II. Фрагмент EcoR I-Hind III получают из SVHPlac и пришивают к фрагмен50 ту EcoR I-Hind III PSVOd, который содержит плазмидную основу репликации, и отбирают плаэмиду pSVHPOd. 3aтем получают фрагмент EcoR I-Hind III из 340 п.о. плазмиды PSVHPOd, эатупляют с обоих концов ДНК-полимеразой и сшивают с описанным Xho I-переваренным, тупоконечным вектором р91023 (С) . Полученную плаэмиду, в которой ориентация фрагмента Hind 1IIEcoR I такова, что Ваш HI-сайт внутри фрагмента является близлежащим к гену VA, называют pES 105. Плазмиду

pES 105 переваривают Bam HI u Pvu II, а также отдельно Pvu II, и выделяют фрагмент Bam HI-Pvu II, содержащий основной поздний промотор аденовируса (фрагмент В), и фрагмент Pvu II, содержащий ген устойчивости к тетрациклину, а также другие последовательности (фрагмент С). Фрагменты А, В и С сшивают и полученную плаэмиду выделяют и обозначают RK1-4. Плазмида РК1-4 депонирована в коллекции

American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящим номером АТСС 39940.

П р и и е р 9. Экспрессия ЭПО в клетках СНО (метод I).

20 мкг ДНК иэ плазмиды pPTF L 13, описанной по примеру 5, расщепляют эндонуклеаэой Cla I плаэмиды и сшивают с Cla I фрагментом ДНК плазмиды

pAdD 26 SVp(A)I (2 мкг), которая содержит интактный ген дигидрофоля- . тредуктазы (DHFR), приводимый в действие основным поздним промотором аденовируса. Эту ДНК используют для трансфекции DHFR — отрицательных клеток СНО и после двухдневного выращивания отбирают на альфа-средах, не имеющих нуклеотиды, и пополняют

10Х.-ной диализованной фетальной бычьей сывороткой. Вслед эа ростом в течение двух недель в избирательных средах колонии извлекают, объединяют по группам из 10-100 колоний на пул, повторно высевают и выращивают до слияния в альфа-средах, не имеющих нуклеотиды. Отстоявшиеся среды нэ пулов, выращенных до метотрексатной селекции, анализируют ЭПО посредством радиоиммуноанализа (RIA) . Пулы, которые показывают наличие ЭПО, выращивают в присутствии метотрексата (МТХ) (0,02 мкМ), субклонируют и анализируют. Cla 44,02-7 пул высвобождает

460 нг/мл ЭПО в среду. Эта клеточная линия выбрана для получения ЭПО и депонирована в коллекции American

Туре Culture Collection под номером

ATCC CRLI 8695.

Этот клон подвергают поэтапному отбору при возрастающих концентраци1672930

30 ях, 1Тл и обнаруживают даже более высокие уровни синтеза ЭПО.

На каждом этапе ЭПО измеряют в надосадочном слое культуры посредст5 вом RIA и биологической активности

in vitro. Уровни используемого метотрексата составляют 0,02, 0,1 и

0,5 мкМ, после первого цикла селекции при 0,02 мкМ MTX в культуральные среды высвобождаются значительные уровни ЭПО.

Пример 10, Экспрессия ЭПО в клетках CHO.

ДНК клона A-HEPOF L 13 переваривают EcoR I, и малый фрагмент RI, содержащий ген ЭПО, клонируют в EcoR Iсайт плазмиды R К1-4 (пример 9) ° Эту

ДНК затем используют для трансфекции 0НРК вЂ” отрицательных клеток СНО прямо (беэ переваривания), селекцию и амплификацию осуществляют, как описано.

ДНК PKF L 13 также встраивают в клетки СНО путем слияния протоплас- 25 тов и микроинъекции. Плаэмида PKF

13 депонирована в коллекции American Type Culture Collection, Rockville, Maryland под номерам АТСС

39989.

Пример 11 ° Экспрессия клона

ЭПО в клетках COS-1.

ДНК плазмиды рБЧОВ переваривают рестриктазой Hind III и эатупляют

ДНК-полимеразой I. ДНК клона ЭПО, Q-HEPOF, переваривают до готовности

EcoR I u Hind III и фрагмент размером 4,0 т.п.о., содержащий ген ЭПО, выделяют и затупляют, как описано.

Фрагмент гена ЭПО вставляют в плаз- 40 мидный фрагмент pSVOd. Плазмида

CZ 2-1 имеет ген ЭПО в ориентации а (т.е. с 5 -концом ЭПО, самым ближайшим к началу SV 40), а плазмида CZ

1-3 находится в противоположной орН 45 ентации.

Плаэмиды CZ 1-3 и CZ 2-1 трансфекцируют в клетки COS I по примеру

6, среды собирают и анализируют на унологически реактивный ЭПО При- 50 близительно 31 нг/мл ЭПО обнаружено в культурах CZ 2-1 и 16-31 нг/мп— в культурах CZ 1-3 °

Геномные клоны НЕРО1, НЕРО2 и

НЕРО6 могут быть вставлены в клетки

COS для экспрессии аналогичным образом.

Пример 12. Экспрессия в клет ках С127 и 3Т3.

При конструировании рВРУЕРО плазмиду SP6/5 переваривают рестриктаэой

EcoR I и соединяют с фрагментом

EcoR I (1340 п.о.) из 9,-HEPOF L 13 при помощи ДНК-лигазы. Полученную плазмиду, в которой 5 -конец гена

ЭПО является ближайшим к промотору

SP6, обозначают pEP049F. В этой ориентации сайт Bam HI в полилинкере P

Р6/5 непосредственно примыкает к

5 -концу гена ЭПО.

Плазмиду pd ВРУ-MMTheo (342-12) переваривают Bam HI для получения двух фрагментов: большого фрагмента

8,0 т.п.о., содержащего геном ВРУ, и меньшего фрагмента, 6,5 т.п.о., содержащего pNL 2 начало репликации и ген ампициллин-устойчивости, металлотионеинового промотора, ген неомицин-устойчивого и сигнал полиаденилирования SV 40. Переваренную ДНК сшивают ДНК-лигазой и плазмиди, которые содержат только 6,8 т.п.о. фрагмент, идентифицируют перевариваниями рестрикционными эндонуклеазами

EcoR 1 и Bam HI. Плазмида обозначена рИМТпеоВРУ. рЕР049 f переваривают

Bam HI u Bgl II, и выделяют 700 п.о. фрагмент, содержащий целую ЭПО-кодирующую область. Bgl II-переваренную

pMMTheoBPy и фрагмент Bam HI/Bgl II

ЭПО (700 п.о.) сшивают, и идентифицируют гибридизацией в колониях при помощи оликонуклеотидного d (GGTCATCTGT-CCCCTGTCC) (зонда, являющегося специфичным к гену ЭПО). Плаэмиду (pEPO15a), которая имеет кДНК

ЭПО в ориентации так, что 5 -конец

) кДНК ЭПО является близлежащим к металлотионеиновому промотору, идентифицируется путем переваривания

EcoR 1 и Kpn I.

Плаэмиду pdBPy-MMTneo (342-12) переваривают Bam HI, выделяют фрагмент длиной 8,0 т.п.о., который содержит целый геном вируса бычьей папилломы, и сшивают его с Bam HI фрагментом, рЕР015а, идентифицируют плаэмиду (рВРУ-ЭПО) гибридизацией в колониях с использованием олигонуклеотидного зонда Й (P-CCACACCCGGTACACA-OH) i который является специфичным к геному ВРУ. Плазмида pdBPy-MMTneo (342-12) депонирована в American Type Culture

Collection, Rockville Maryland под номером ATCC 37224.

Методы I-III используются для экспрессии ЭПО.

1672930

Метод I. 25 мкг ДНК рВРУ-ЭПО используют для трансфекции 1х 10 клеток

С127 СНО, используя стандартные методики. Через 5 ч после трансфекции среды удаляют, клетки обрабатывают глицерином, промывают и прибавляют свежую L-среду, содержащую 10Х-ную фетальную бычью сыворотку. Через 48 ч клетки трипсиниэируют и расщепляют в соотношении 1:10 в DME среде, содержащей 500 мкг/мп G418, а клетки выращивают в течение 2-3 недель.

G418 — устойчивые колонии, выделяют и выращивают в присутствии С418, затем промывают, прибавляют свежие среды, содержащие 107-ную фетальную бычью сыворотку, и среду собирают через 24 ч. Среды являются положительными для ЭПО при радиоиммунном анали-20 зе и биологической пробе in vitro.

Метод II. Клетки С127 и ЗТЗ трансфецируют 25 мкг ДНК рВРУ-ЭПО и

2 мкг ДНК PSV 2 neo. Вслед эа трансфекцией применяют метод I. 25

Метод III. Клетки С127 трансфецируют 30 мкг ДНК рВРУ-ЭПО по методу I.

Вслед 3а трансфекцией и расщеплением (1: 10) среды меняют каждые три дня.

Приблизительно через 2 недели лоявля- 3р ются очаги ВРУ-трансформированных клеток. Отдельные очаги собирают, выращивают до субсливающегося монослоя и анализируют на активность ЭРО или его антигенность в кондиционирован- 35 ных средах.

Пример 13. Экспрессия в клетках насекомых. Конструирование pIYEY

EP0F ? 13 °

Плазмидный вектор pIYEY депониро- 4р ван в American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящим номером АТСС 39991 °

pIYEY переваривают EcoR I, затупляют с использованием большого фраг- 45 мента ДНК-полимеразы I, и одиночный линкер Not I

GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG

50 сшивают с тупым концом. Полученную плазмиду обозначают pIYEY NI.

pIYEY переваривают Smal и одиночный линкер Sfi I

GGGCCCCAGGGGCCC

CCCGGGGTCCCCGGG сшивают с тупым концом. Полученную плазмиду обозначают pIYEYSI.

Плазмиду pIYEYSI переваривают

Крп I и отщепляют от 0 до 100 п.о. от каждого конца путем переваривания двунатриевой эндонуклеазой Bal 31.

Полученные концы, которые не совсем тупые, затупляют с использованием большого фрагмента ДНК-полимеразы I, и полилинкер

Xho I Xba I

1 r 1

BglI II EcoR I

Кп I

AGATCTCGAGAATTCTAGATGGATGGTACC

TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG сшивают с тупым концом. Полилинкер вставляют в обеих ориентациях. Плазмиду, в которой ориентирован полилинкер таким образом, что сайт Bgl II внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют pIYEYS IBg Кр. Плазмиду, в которой сайт Kpn I внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют р?УЕУБ1 KpBg. Число пар оснований, которые были потеряны между первоначальным Крп 1-сайтом в р?УЕУБ1 и полиэдральным промотором, не определено. р?УАУБ IBg Кр депонирована в

American Type Culture Соllесtion, Rockville, под входящим номером АТСС

39988.

pIYEY NI переваривают Kpn I u

Pst I. Большой фрагмент, который содержит начало репликации и 3 -конец полиэдрального гена, выделяют (фрагмент А). pIYEYS IBg Кр переваривают

Pst I и Крп и меньший фрагмент, который содержит полиэдральный генный промотор и полилинкер, выделяют (фрагмент В). Фрагменты А и В объединяют

ДНК-лигазой для образования новой плаэмиды pIYEYS 1Вр KpNe, которая содержит частично потерянный полиэдральный ген, в который вставлен полилинкер и Not I-сайт, который прикрывает фланг полиэдрального генного участка.

pIYEYS IBG Kp NI переваривают

EcoR I и вставляют фрагмент EcoR I длиной 1340 п.о. из 71 -HEPOF Ь 13.

Плазмидй, содержащие ген ЭПО в ориентации так, что 51 -конец гена ЭПО является близлежащим к полиэдральному промотору и 3 -концу полиэдрального

) гена, идентифицируют путем перевари-, вания Bgl II. Одну из этих плазмид обозначают как рТУЕРО.

1672930

Экспрессия ЭПО в клетках насекоПлазмидную ДНК плаэмиды р1УЕРО выделяют и подвергают дальнейшей очист5 ке CSCl-центрифугированиеи. ДНК-штамма

L I вируса полиэдроза Autographa california дикого типа (AcNPY) получают фенольной экстракцией вирусных частиц и последующей очисткой вирусной ДНК, Эти две ДНК трансфецируют в клетки IPL В-SF-21. Для каждой чашки трансфецируемых клеток используют хомутик

ДНК AcNPY .дикого типа и 10 мкг pIYEPO. о

Чашки инкубируют при 27 С в течение

5 дней. Затем собирают надосадочную жидкость, и экспрессию ЭПО в надосадочном слое анализируют радиоиммунным анализом и биологической пробой in

vitro, Пример 14. Очистка ЭПО.

Среды клеток COS (121) с концентрациями ЭПО до 200 мкг/л концентрируют 75 до 600 ил с использованием ультрафильтрационных мембран, диафильтруют против 4 мл 10 иИ раствора фосфата натрия, рН 7. Концентрированные и диафильтрованные кондиционированные сре- 30 ды содержат 2,5 мг ЭПО в 380 мг общего белка. Раствор ЭПО дополнительно концентрируют до 186 мп,и .осажденные белки извлекают пентрифугированием при 110000 a g в течение 30 мин.

35 рН надосадочного слоя, который содержит ЭПО (2 мг), доводят до рН 5,5 с помощью 50Х.-ной уксусной кислоты, о перемешивают при 4 С в течение 30 мин. и осадок извлекают центрифугированием 40 при 13000 х g в течение 30 мин.

Верхний слой (20 мл), содержащий

200 мкг ЭПО (24 мг общего белка), наносят на колонку с СМ-сефароэой (20 мл), уравновешенной в 10 мМ аце- 45 тата натрия (рН 5,5), промывают 40 ил того же буфера, ЭПО, связанный с

СМ-сефарозой, элюируют 100 мл градиента NaV (0-1) в 10 мМ растворе фосфата натрия (рН 5,5). Фракции, содержащие ЭПО (общее количество 50 мкг

50 в 2 мг общих белков), объединяют по группам и концентрируют до 2 мл с использованием ультрафильтрационной мембраны.

Сконцентрированные фракции иэ

СМ-сефарозы подвергают дальнейшей очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, используя колонку Vydac С-4.

ЭПО подают на колонку, уравновешенную 10Х-ным растворителем В (растворитель А представляет собой 0,1%

CF C0 H в воде, растворитель В представляет собой 0,1% CF CO H в СР СИ), с низкой степенью подачи (1 ип/мин).

Колонку промывают 10%-ным растворителем В в течение 1О мин и ЭПО элюируют линейныи градиентом В (10-70Х) в течение 60 мин. Фракции, содержащие ЭПО, объединяют по группам (40 мкг ЭПО в 120 мкг общих белков) и лиофилиэируют. Лиофилизированный ЭПО повторно растворяют в

0,1 М растворе Tris-НС1 (рН 7,5), содержащем О, 15 N NaCl, и повторно хроматографируют ВЭЖХ с обращенной фазой. фракции, содержащие ЭПО, объединяют по группам и анализируют электрофорезом в SDS-полиакриламидном (1ОХ) геле. Объединенные фракции ЭПО содержат 15,5 икг ЭПО в 25 икг общего протеина.

Формула изобретения

Способ получения кДНК-клонов, кодирующих человеческий эритропоэтин, включающий отбор клонов в результате гибридизации библиотеки кДНК-клонов с маркированным радиоактивным фосфором зондои и последующее выявление целевых клонов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа и выхода эритропоэтина при экспрессии в животных клетках, отбор клонов проводят в результате гибридизации Я кДНК-библиотеки бактериофага мРНК фетальной печени с олигонуклеотидными зондами

А А А А А А

TTCCANGCGTAGAAGTT, ССАМСССТАСААСТТИАС

TTGN Т Т TTGN Т Т

ТАСАССТААСТТССТ, ТАСАССТААСТТСТТ, которые получают путем выделения и очистки эритропоэтина иэ мочи людей, страдающих апластической анемией, путем фракционирования жидкостной хроматографией высокого давления и элюирования с помощью О-95Х-ного градиента ацетонитрила и 0,1Х-ной трифторуксусной кислоты, определения аминокислотной последовательности эритропоэтина в результате переваривания эритропоэтина трипсином при рН 7 и .температуре 37 С, выбора трипсиновых

1672930

Составитель Т.Забойкина

Техред М,Моргентал Корректор М. Самборская

Редактор И.Дербак

Заказ 2848 Тираж 367 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина,101 фрагментов Val-Азп-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys- аминокислоты 46-52 или Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg- аминокислоты

144-150 для синтеза олигонуклеотидов, причем гибридизацию проводят при

48 С в течение 3 дней, а выявление целевых клонов осуществляют с помощью авторадиографии.