Способ идентификации сортов сахарной свеклы

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к биохимическим методам сортовой идентификации. Целью изобретения является повышение точности определения. Способ состоит в том, что проводят электрофоретический анализ функциональных белков-ферментов, на его основе подсчитывают частоту встречаемости генотипов по ферментным локусам, по которой судят об идентичности или отличии исследуемых сортов. 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕ СКИХ

РЕСПУБЛИК (s>)s А 01 Н 1/04

ГОСУДРРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4661371/13 (22) 13.03.89 (46) 30.08.91. Бюл. N. 32 (71) Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара им.

А.Л.Маэлумова (72) Н, С.Агафонов, Т.П.Жужжалова, Е.В.Левитес, Т.П.Федулова и А.А.Коновалов (53) 631.153.14.5 (088.8) (56) Лесневич Л.А.. Болелова З.А. Оценка и изучение генофонда свеклы по белкам-маркерам, — С/х биология, 1987. 1Ф 4, с. 58 — 63.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к биохимическим методам сортовой идентификации.

Цель изобретения — повышение точности определения, Способ состоит в том, что после электрофореэа анализу подвергают функциональные белки-ферменты отдельного семени, а затем на основе злектрофоретических спектров подсчитывают частоты встречаемости генотипов по ферментным локусам, по которым судят об идентичности или отличии исследуемых сортов.

Способ осуществляют следующим образом.

Определяют идентичность или отличие семян различных сортов.

Для анализа берут выборки в 50-100 семян исследуемых сортов. Размер выборки обусловлен использованием критерия Х при математической обработке полученных данных.

Семена освобождают иэ околоплодников, измельчают на предметном стекле в капБЫ 1672999 А1 (54) СПОСОБ ИДЕН1 ИФИКАЦИИ СОРТОВ

САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству. а именно к биохимическим методам сортовой идентификации. Цель изобретения — повышение точности определения, Способ состоит в том. что проводят электрофоретический анализ функциональных белков-ферментов, на его основе подсчитывают частоту встречаемости генотипов по ферментным локусам, l10 которой судят об идентичности или отличии исследуемых сортов, 6 табл.

% ле воды или буфере. В полученной суспензии смачивают кусочек хроматографической бумаги "Ватман 3 мм" размером Зх5 мм, который затем вставляют в стартовую щель гелевого блока для электрофореза. Гелевый блок готовят из гидролиэованного крахма- в ла. ос

Способ приготовления гидролизованного крахмала следующий.

Промышленный пищевой картофельный крахмал в количестве 250 r помещают в литровую широкогорлую колбу и ставят в Q термостат при 37 С. Отдельно готовят под- К) кисленный раствор ацетона, Для этого в пол-литровую бутыль. содержащую 0,5 л ацетона, добавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты (ОСЧ), закрывают пробкой и ставят в термостат при 37 С. После того, как крахмал и ацетон прогреваются до 37 С. реакцию гидролиза запускают, выливая подкисленный ацетон в крахмал.

Время гидролиза крахмала 15 мин, Останавливают гидролиэ добавлением 250 мл 1 М раствора ацетата натрия. Каждый образец

1672999 крахмала с определенным временем гидролиза тщательно обмывают на воронке Бюхнера десятикратным количеством дистиллированной воды, после чего осушают его на воронке ацетоном (100 мл), затем раскладывают на лист фильтровальной бумаги и сушат при комнатной температуре.

Первоначальную оценку крахмала проводят по качеству приготовленного из него геля. Для приготовления геля берут 20 г гидролизованного крахмала, 20 г сахарозы и 140 мл 0.75 М трис-цитратного буфера, рН

7,0, гелевого буфера и помещают в колбу объемом 500 мл. Смесь разогревают на электроплитке или газовой горелке при непрерывном помешивании. Если время гидролиза подобрано правильно, то раствор крахмала при нагревании сначала загустевает, а при дальнейшем нагревании раэжижается и начинает кипеть с большим количеством мелких пузырьков воздуха, Нагревание продолжают до появления крупных редких пузырьков воздуха, после чего нагревание прекращают. В нормальном хорошем крахмале пузырьки воздуха сразу исчезают и раствор становится прозрачным, Горячий раствор крахмала заливают в кювету, в которой он полимериэуется в течение 1,5 — 2 ч. Полностью эаполимеризовавшийся гель должен быть достаточно прочным и эластичным.

Гель в заправленной кювете имеет центральную горизонтальную часть, которая переходит, не прерываясь, в две боковые вертикальные части, предназначенные для непосредственного контакта геля с электродным буфером, Перед нанесением образцов гель охлаждают в холодильнике до

2 — 4 С, не допуская его замораживания, Для электрофореэа используют трисцитратную буферную систему. Электродный буфер 0,1 М трис-цитратный, рН 7,0, Целесообразно использовать в одном приборе ферменты с близкой электрофоретической подвижностью, что позволяет использовать гелевый блок соответству>ощего размера и, следовательно, экономить материал и время.

После окончания электрофореза гель извлекают из кюветы, разрезают на пластинки толщиной 1,5 мм и окрашивают на соответствующие ферменты (табл.1).

В среду для малик-фермента добавляют

2 мг М9С12, Пластины геля инкубируют при 37 С до четкого проявления, Затем зимограммы промывают водой, зарисовывают или фотографируют спектры изоферментов, I

Зимограммы фиксируют в смеси глицерин — вода(4:10) втечение сут при 4 С, затем покрывают с обеих сторон листками целлофана и высушивают. Высушенные пластины

5 хранят длительное время в темноте, в сухом месте.

На электрофореграммах получают спектры ферментов разной подвижности. Давве подсчитывают количество семян с каждым

10 вариантом генотипа по данному ферменту в общей выборке и определяют частоту встречаемости генотипов. Например, сравнивают два сорта Белоцерковская одн, 34 и Рамонская одн. 32 по малик-ферменту (табл.2).

15 Показатель r сходства этих двух популяций выч рмуле

Г=

° °

+ 0,271 0,164 = 0,875.

20 Значение показателя г не превышает 1.

Оно равно 1 в тех случаях, когда сравнивввмые сорта идентичны по частотам встречвамости. Показатель г = О, когдв сравниваемые популяции не имеют ни одно25 го общего аллеля. В остальных случаях показатель г сходства имеет промежуточное значение между 0 и 1. Показатель r сходства является мерой попарного сходства популяций. Его можно интерпретировать как час30 тоту общих аллелей в сравниваемых сортах, После вычисляют критерий идентичности

8 М1 N> (1 — 2)

N) +Иг

35 где N> — общая выборка семян в первом сорте;

Nz — выборка семян во втором сорте.

48+55 (1 — 0,875) = 2,39, Величина распределена так же, как и

Х, если превышает табличное значение Х

45 с заданным уровнем значимости, то между выборками есть различие, Х табл. = 5,991 при уровне значимости P - 0,05 (,. И таким образом сравнивают все сорта друг с другом и по всем трем ферментным локусам.

По результатам математической обработки судят об отличии или сходстве сравниваемых сортов по частотам встречаемости изоферментн ых локусов.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. По указанной выше методике проводят анализы и последующую математическую обработку. Результаты представлены в табл.3. Идентификацию

1672999

Таблица 1

Состав инкубационных смесей для различных ферментов

Фермент 0,1 М трис-HCI, рН8, 9, мл

НАД, Субстрат, мл

Са CI2 мг

ЭДТА, НТС, мг

ФМС, НАДФ, Агаромг мг за

2, мл мг мг

МДà — НАД 5

1М малат

0,1 мл

1М малат

02 мл

1М гл тамат

0,3

Малик— фермент

0,3

0,3

МДà — малатдегидрогеназа, ГД вЂ” глутаматдегидрогеназа

НСТ вЂ” нитросиний тетразолий

НАД вЂ” никотинамидадениндинуклеотид

НАФД вЂ” никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ФМС вЂ” енаэинметас льфат

Таблица 2

Сравнение сортов свеклы по малик-ферменту сортов ведут путем сравнения частот встречаемости изоферментных локусов по величине критерия идентичности (X табл. = 5,99), г

Так как I (58,76) > X табл.(5,99) по Mod

-1, то по другим локусам проводить анализ 5 (сравнение) нет смысла, сорта уже различаются.

Пример 2. Все приемы аналогичны примеру 1, сравнивают другие сорта свеклы. Результаты представлены в табл.4. 10

По локусу Mod — 1 различий не обнаруживается. так как I (089) <Х табл (5,99), поэтому необходимо сравнение по следующему ферменту (Мог-1). В данном случае I (10,04) > Х табл, т.е. сорта различа- 15 ются, сравнение по третьему ферменту не обязательно.

Пример 3, Все приемы проеодят аналогично примеру 1. Результаты представлены в табл.5, 20

По локусам Мо4 — 1 и Мог — 1 различий нет. Необходимо сравнение по третьему локусу. В данном случае 1(78,0) > Х табл., т,е. г сорта различаются по третьему локусу (изоферменту), При увеличении числа сравнива- 25 емых сортов может быть увеличено число изоферментов.

В табл.6 представлены показа-,ели сходства и различия сортов сахарной свеклы по изоферментным локусам (значения критерия идентичности).

Настоящий способ достаточно точно позволяет устанавливать сходство или различие исследуемых сортов сахарной свеклы.

Формула изобретения

Способ идентификации сортов сахарной свеклы, включающий электрофореэ экстрагированных белков семян и анализ полученных электрофоретических белковых спектров с установлением идентичности или отличия исследуемых сортов, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения точности определения.анализу подвергают спектры функциональных белков-ферментов, подсчитывают частоту встречаемости генотипов по ферментным локусам, по которой судят об идентичности или отличии сортов.

1672999

Таблица 3

Сравнительный анализ сортов свеклы Киргизская одн. 25 и Межотненская р7р

Значение к ите ия I

Сравниваемые сорта

Mod — 1

Мог — 1

Gdh — 1

Киргизская одн, 25

Мекотненская 070

58,76

Таблица 4

Сравнение сортов свеклы Ялтушковская одн. и Белоцерковская одн. 34

Значение критерия !

Мог — 1

Сравниваемые сорта

Мо4 — 1

G0h — 1

Ялтушковская одн, Белоцерковская о н.34

10,04

089

Таблица 5

Сравнение сортов Рамонская одн, 32 и Белоцерковская одн. 34

Значение к ите ия !

Мог — 1

Сравниваемые сорта

Mod — 1

Gdh -1

Рамонская одн. 32

Белоцерковская о н.34

2,39

2,52

78,96

Таблица 6

Показатель сходства или различия сортов сахарной свеклы по изоферментным локусам (значение критерия идентичности) одн. 32 одн.

По малик-ферменту

Белоцерковская одн.34 2,39

0,89 20,97

23,74 5,42

10,99

31,20

0,44

34,57 6,01

4,26

Ялтушковская одн.

29,57 40,21 4,64

6,04

Межотненская

070

35, 88 45, 16 58, 76

34,15 62,36

Верхнячская

О/2

5,47

Названия сортов

Рамонская одн.32

Рамонская

036

Рамон- Ялхужская ковская

Межотнен- Рамонская 070 ская

036

Верхняч- Киргиз- Североская 072 ская Кавказодн,25 ская одн.42

1672999

Проделжени» табл.6

Киргиз

Рамонодн.

По глутаматдегидрогенаэе

Белоцерковская од.34

46,67

/8,96 25,92 0,98

88,02 73,20 43, 13

0 80 2,40

52,27

49,17

88, 13 0,80

Ялтушковская од.

66, 76

52,02 85,38 117,79 4,45

Межотненская

28,97

31,38

0,26

4,64

070

45,47

7,62

48, 89

Верхнячская

072

43,13

8,12

Киргизская одн.25

7,12

По малатдегидрогеназе

Белоцерковская одн.34 2,52 10,04 29,75

29, 56

3,57 19,57 41,35

15,88

29,92

3,32 2,07

5,10

11, 96

Ялтушковская одн.

6,38

18,01

/,33

6,21

20, 93

Межотненская

О/О

19, 74

14, 77

35,21

3,31

30,36

25,08

9, 18

Верхнячская

О/2

23,040 33,60

Киргизская одн.25

58,88 (Х табл.5,99) Составитель В. Демкин

Редактор М. Кобылянская Техред М,Моргентал Корректор Л. Бескид

Заказ 2867 Тираж 358 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Названия сортов

Рамонская од.32

Рамонская

036

Рамонская одн.32

Рамонская

036 ская одн. 32

Ялтуш- Мекотненконская ская О/О

Рамонская

036

Верхнячская 072 ская одн.25

СевероКавказская одн.42