Способ определения отрицательных зарядов на поверхности клеток эритроцитов

 

„„SU„„1684680 А 1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1)5 G 01 N 33! 0

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ:.

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ д смаке и

1 (21) 47653Я/14 (22) 04.12.89 (46) 15.10. J1. Бюл. td 38 (71) 2-й 11осковский государственный медицинский институт им, Н.И. Пирогова (72) В. Н. Захарченко, Т.П. Сурикова и В.fl. Захарова (3) 621,015{088.8) (р6) J. Phisiol, СЬев. 1975, v. 356, р. 1727. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТРИЦАТЕЛЫ<ЫХ

ЗАРЯДОВ НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК ЭРИТРОЦИТОВ (7} Изобретение относится к медицине

Изобретение относится к медицине, а именно к изучению поверхностных слоев клеток эритроцитов адсорбционными методами, и может быть использо" вано для определения числа отрицательных зарядов на клеточной поверхности эритроцитов в норме и при патологическом состоянии, например при сахарном диабете.

Цель изобретения - ускорение и упрощение способа - достигается тем, что отмытую эритроцитарную массу смешивают с раствором катоннрго красителя в концентрации 4,3-27 г/м при

cooTношении объемов 1;9 и инкубируют в течение 2-3 ч при 18-22 С, отделяют эритроциты от раствора, который фотометрируют. По значению адсоборции красителя проводят расчет числа зарядов на клеточной поверхности эритроцитов, исходя из формулы

2 и может бысть использовано для определения отрицательных зарядов на клеточной поверхности эритроцитов в норме и при патологических состояниях, например при сахарном диабете. Целью изобретения является упрощение и ускорение способа. Отмытую эритроцитарную массу смешивают с раствором катионного красителя в концентрации 4,3

2,7 г/и при соотношении объемов 1:g, инкубируют 2-3 ч при 18-22 С, отделяют эритроциты от раствора, который фотометрируют. По значению предельной адсорбции красителя проводят расчет числа зарядов на клеточной поверхности эритроцитов. 1 ил., 1 табл. где N - число отрицательных зарядов на один эритроцит;

NA - постоянная Авогадро;

А„ - предельная адсорбция краситеCb ля, мол ь/м ; 00

n - -число эритроцитов в единице объема. 1Ь

Способ основан на том, что отрицательный заряд клеточной поверхности С эритроцитов полностью нейтрализуется положительным зарядом катионного красителя при его предельной адсорбции.

С ростом концентрации красителя в Зь растворе его адсорбция асимптотически приближается к предельной. При низких концентрациях красителя поверхность эритроцитов далека от насыцения, Этим обусловлен выбор нижнего предела кон1684680

Л рлдкс

N и 7 з где .1, == 6,02.1<>

:Ъ 1

90 10 ®

40 и v макс,л . 1 ° "ле

45 р,С вЂ” изменение равновесной концентрациии в результате поггощенип красителя, г/м ,3

М - молекулярная касса красителя, г/)лол ь, 442, 6;

И - обьем кпеток, м

V - обье(л изотонического раствора

Ъ красителя, и

Таким образом

6, 023 ° 1(> . 1 ° .1(> <.>О 10--18 5

4!1",, 1 (> - 4 — 1,9 1О центрации используемого красителя в растворе. При концентрациях красителя, больших >О г/>л, происходит насышение раствора красителя, имеющего органическую растворимост в изотоническом растворе хлорида натрия. Адсорбц1лонное равновесие достигаетсп за

2-3 ч при 1<)-22<>С.

Способ поясняется примерами.

П р и и е р 1, Эритроциты, выделенные из донорской крови практически здоровых людей, трижды отмывают изотоническим раствором (0,14 М) хлорида натрия, при рп =- 7,2. Для отмь1вки на 1 >лл эритроцитарной массы берут

3 мл растаора хлорида натрия. После цен TриФугHрoeаHvlR 1 мл эритроцитар»ой массы добавляют к 3 мл кр:-сителя катионного синего 0 с концентрацией ?О красителя 27 г/м в изотоническом растворе при указа11ном выше рН, в" тряхиваюг и выдер>нивают полученную суспензию 3 ч при 18 С. Отделяют эритроциты о раствора центри@угированием.

После адсорбции раствор фотометрируют при !0 нм. Измерения проводят на ,(> )то,<ог>ори>летре l(QI(-2.

1>р»д<-);b,ai> концентрац1>я адсорбиро" ванноГо красИтеЛя составиЛа 1 1-/и

„3

Число отрицательных зарядов, оцениваемое я (относительный заряд одной мо) уЛы i päситсг1» рзB»H + 1 } рассчи тыва пи и<; ф.>р>луг>е

П р и 11 е. р ?. 1 мл эри-роцитарной массы, F.ûäåëåèíîé и отмытой по примеру 1, добавляют к 9 мл изотонического ра:твора,<рзсителя, содержащего

4 3 г/м катионного синегo О. Получен9 ну а суспензию встряхивают, вь1держивают 3 ч и повторяют методику определения: оличества красителя, поглощенного клетками, описанную в примере 1, Предельная конце«трация адсорбированного красителя равна 2,3 г/>л .

Чисг>о отрицательных зарядов при предельной ад<;орбции О, 26 1<> .

Пример >, 1 мл эритроцитарнсй кассы, выделенной и огмытой по примеру 1, добавляют к g мл изотони- . чсского раствора красителя катион Io гс синего О, содержацего l у, о г/.л з, вс тряхивают, выдерживают полученную сусг>ензию 3 ч и повторяют методику onр»д-ле«ия количества красителя, поглоц»ннс о клетка ли, описанную в при)лер» 1.

Предельная концентрация адсорбиропанного красителя оавна 11,7 г/м - исло отрицательных зарядов при пр»д льной >дсорбции 1,7 ° 10, П р и и е р 4. Эритроцить, выдег>енные и от >b>Tbl» по примеру 1, отвержда" ют глутаровык альдегидом следуюцим образом. Б эритроцитарную массу добавляюг отвердитель (100 кл 1б-ного раствора Hà >0 кл эритроци TQB), инкубируют сутки при 0- ) С, избыток глутарового апьдегида удаляю> обработкой О, 15 М раствора глицина. После отделения эритроцитарной массы ее отмывают изотоническик раствором, как указано в при>лере 1. 1 )лл эритроцитарной массы с>лешивают с g мл изотонического раствора, содержацего 0, 14 И хлорида натрия и краситель катионный синий 0 в концентрации 27 г/и, при рП 7,2, Повторяют методику определения количества красителя, поглоценного клетками, г;писак1ую з примере 1„

Предельная концентрация адсорбированного красителя составила 1<> г/м

Э

Число отрицательных зарядов при предельной адсорбции,оказалось равным

)i1J7

Таки)л образом, отверждение эритроцитов не оказывает существенного влия11ия на число зарядов на поверхности эритроцитов.

П р и и е р j. Эритроциты, выделен-1ые из крови б )ль11ого (74 года ) сахарлыл диабетом средней тян(ести с гепанЬс ч

20 д макс ц

NA Лмокс

N и

Ф где И

nAмакс

Сравнение способов определения отрицательных зарядов на поверхности клеток эритроцитов

Предложенный способ

Время определения заряда, ч

Проводимые операции

2-4

20-24

1. Выделение клеток

2, Отмывка от белков

3. Инкубация с краси-. телем

1. Выделение клеток

2. Отмывка

3. Гемолиэ

5 16846 гиепатией нижних конечностей, были соработаны согласно в примеру 1.

Предельная адсорбция составила

4,7 г/ л .

Число отрицательных зарядов равно

0,6-10

Пример 6. Эритроциты, выделенные из крови больного (46 лет) сахарным диабетом средней тяжести, обрабатывали согласно примеру 1 °

Предельная адсорбция красителя оказалась равной 12 г/и, Число отрицательных зарядов равно

1, s9 ° 10 1>

П р и и е р 7, Эритроциты, выделенные из крови больного (22 года) сахарным диабетом тяжелой формы, были обработаны согласно примеру 1.

Предельная адсорбция составила

8.4 г/м, Число отрицательных зарядов равно

0,92 10

Из приведенных выше примеров следует, что у1леньшение числа отрицательных зарядов на поверхности эритроцитов коррелируется с тяжестью заболевания сахарным диабетом.

0 преимуществах предлагаемого спо" соба можно судить по данным, приве- ЗО денным в таблице.

Ошибка расчета по способу-прототипу составляет 20, по предлагаемому способу - 5Ô.

Полученные согласно предлагаемому 35 способу данные могут быть использованы для выяснения механизма патологии и разработки способов лечения сахарного- диабета.

Формула изобретения 40

° Способ определения отрицательных зарядов на поверхности клеток эритроСравнивае лые . Способ-прототип признаки

G0

6 цотов путем обработки эритроцитарно массы, отделения исследуемого раство" ра ".. последующим его спектрофотометрированием и расчетом числа отрица" . тельных зарядов, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, эритроцитарную массу обрабатывают раствором катионного

3 красителя с концентрацией 4-27 г/ л при соотношении объемов 1:3, смесь инкубируют 2-3 ч при 18-22 С, в качестве исследуемого раствора используют центрифугат, получаемый при отделении эритроцитов, в котором определяют экстинкции при 590 нм, затем .расчитывают адсорбцию красителя по формуле

> где g С вЂ” изменение равновесной концентрации в результате поглощения красителя;

V — объем раствора кра сителя;

И - 1лолекулярная масса красите- ля;

W — объем клеток, а число отрицательных зарядов рассчитывают по Формуле число отрицательных зарядов на 1 эритроцит; постоянная; предельная адсорбция красителя; число эритроцитов в единице объема .

1684680

Продолжение таблицы

П))едложенный способ

Сравниваемые, Способ-прототип признаки 4. Фотометрирование

4 ° Гидролиз

5. Удаление липидов

6. Хроматографирование

7. Фотометрирование

Используемая аппаратура

1, Центрифуга

1. Центрифуга лабораборная .2. Концентрационный фотоколориметр

2, Устройство для экстракции органическими растворителями

3. Устройство для ионнообменной хроматографии

4. Концентрационный фотоколориметр

Составитель Л. Агуреев

Тохред Л,Сердокова Корректор .А. Обручар

Редактор А, Иаковская

Заказ 3502 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина,101