Способ определения клеточного иммунитета

 

Изобретение относится к ветеринарии, медицине и биологии, точнее к разделу клеточной иммунологии, и может быть использовано для характеристики состояния клеточного иммунитета организма в ветеринарных и медицинских лабораториях иммунологического профиля. Цель - повышение точности и сокращение времени исследования. Цель достигается введением в суспензию лейкоцитов за 30-40 мин до окончания культивирования взвеси инактивированных стафилококков из расчета 150-200 млн микробных тел на 1 мл суспензии лейкоцитов с дополнительной оценкой клеточного иммунитета по фагоцитарной активности лейкоцитов и количеству бластов в одном препарате. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (у)ю G 01 N ЗЗ/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4450822/14 (22) 30.06.88 (46) 23.10,91, Бюл. М 39 (71) Украинский научно-исследовательский ветеринарный институт (72) 8.Г.Квачев (53) 615.375 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 1174033, кл. А 61 К 39/00, 23.08,85. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА (57) Изобретение относится к ветеринарии, медицине и биологии, точнее к разделу клеточной иммунологии, и может быть использоИзобретение относится к медицине, ветеринарии и биологии, разделу клеточной иммунологии и может быть использовано для определения клеточного иммунитета органиэма в клинических и научно-исследовательских медицинских и ветеринарных лабораториях, Целью изобретения является повышение точности и сокращение времени определения.

Способ осуществляют следующим образом.

Отбирают пробу крови объемом 1-2 мл с добавлением 8-10 ед. гепарина на 1 мл крови.

Кровь отстаивают при комнатной температуре 0,5- l 0 ч, отбирают слой лейкоцитов с плазмой, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при

800 об/мин, Плазму крови отсасывают, а из осадка лейкоцитов готовят суспензию, содержащую1,5х10 — 2,0х10 клеток в 1 мл питаб б тельной среды, Суспенэию лейкоцитов наносят нэ обезжиренное стекло в виде капель и помещают во влажную камеру. Лейкоциты инкубируют.,.Я3 1686364 А1 вано для характеристики состояния клеточного иммунитета организма в ветеринарных и медицинских лабораториях иммунологического профиля. Цель - повышение точности и сокращение времени исследования, Цель достигается введением в суспензию лейкоцитов за 30-40 мин до окончания культивирования взвеси инактивированных стафилококков из расчета 150-200 млн микробных тел на 1 мл суспензии лейкоцитов с дополнительной оценкой клеточного иммунитета по фэгоцитарной активности лейкоцитов и количеству бластов в одном препарате. 2 табл, при 4-8 С в течение 1-2 ч. 3а 30-40 мин до окончания инкубации в суспензию лейкоцитов вносят взвесь инактивированных стафилококков иэ расчета 150-200 млн. микробных тел на 1 мл суспензии клеток. По окончании инкубации стекла вынимают из камеры, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают по Паппенгейму. Клеточный иммунитет определяют путем микроскопирования 100200 мононуклеарных лейкоцитов и подсчета среди них числа бластных клеток лимфоидной природы и нелимфоидной (по размерам, =оотношению ядра и цитоплазмы, конденсации хроматина ядра) и определения в этих же клетках на тех же препаратах показателей фагоцитарной активности по поглощению ими инактивированных стафилококков, Результаты реакции учитывают в следующих показателях.

Относительное содержание трансформированных лимфоцитов

В х 100 ф

В+С

1686364 где А — показатель трансформированных лимфоцитов,,ь;

В -- количество трасформированных лимфоцитов;

С вЂ” количество нетрансформированных 5 лимфоцитов.

Относительное содержание трансформированных клеток нелимфоидной природы

Ех100

Е+К 10 где Д вЂ” показатель трансформированных нелимфоидных клеток, ;

Š— количество нелимфоидных трансформированных клеток;

К вЂ” количество нетрансформированных 15 клеток.

Фагоцитарный показатель

T 100

Т+Р где Н вЂ” фагоцитарный показатель,,; 20

Т вЂ” количество фагоцитирующих мононуклеарных лейкоцитов;

Р— количество нефагоцитирующих мононуклеарных лейкоцитов, Фагоцитарное число 25

Л

Ф =—

М где Ф вЂ” фагоцитарное число;

Л вЂ” количество поглощенных кокков;

M — количество мононуклеарных лейко- ЗО цитов, в которых подсчитывали поглощенные кокки.

Число трансформированных лимфоцитов у здоровых людей 41 4, трансформированных клеток нелимфоидной природы 35

22,ь, фагоцитарный показатель 63;ь, фагоцитарное число 8.

Учет реакции IIG бластной трансформации клеток и их фагоцитарной активности прост, удобен, доступен лабораторному ра- 40 ботнику средней квалификации, Блэстные клетки легко идентифицируются ввиду их крупных размеров (в 2-4 раза больше лимфоцитов), отчетливс го увеличения площади цитоплазмы, преобладания в ядре нежного 45 зухроматина ярко — розового скрашивания, Полученные результаты обрабатывают статистически. Для этого удобен метод Монцевичуте — Эрин гене.

Пример 1, Определение клеточного 50 иммунитета больных хронической пневмониейй.

На стационарном лечении находилось

12 больных в возрасте 29-52 лет с диагнозом; хроническая рецидивирующая пневмо- 55 ния, пневмосклероз. Диагноз установлен на основании анамнестических аускультативных, рентгенологических данных и результатах функциональной диагностики, В результате и роведен ного лечения через

24-31 день состояние у всех больных улучшилось и они в удовлетворительном состоянии были выписаны из стационара. Субъективное улучшение сопровождалось улучшением аускультативной, рентгенологической симптоматики и функциональных проб.

При поступлении и перед выпиской у больных отбирали пробы крови и проводили определение клеточного иммунитета согласно предложенному способу.

Для этого у больных отбирали кровь из локтевой вены в объеме 2 мл в обработанные гепарином пробирки, отстаивали 40 мин, переносили взвесь лейкоцитов в центрифужную пробирку и центрифугировали 20 мин при 800 об./мин. Плазму отсасывали, а к лейкоцитам добавляли питательную среду до конечной концентрации 2,0 х 10 клеток в 1 мл суспензии.

Суспензию клеток наносили в виде капель на предметные стекла, помещали во влажную камеру и инкубировали при 4 С 2 ч.

За 40 мин до окончания инкубации в тех же препаратах к каждой капле суспензии клеток добавляли равные по обьему капли взвеси инактивировэнных стэфилококков (150 млн. микробных тел в 1 мл). По завершении инкубации стекла вынимали из камер, споласкивали дистиллированной водой, подсушивали. фиксировали 10 мин в метаноле и окрашивали по

Паппенгейму. После подсчета 100-200 клеток в каждом препарате определяли количество трансформированных лимфоцитов, трансформированных клеток нелимфоидной природы и в этих же клетках -- показатели их фагоцитарной активности. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Из приведенных е табл. 1 данных следует. что определенный по предлагаемому способу уровень клеточного иммунитета коррелирует с изменением клинического состояния больных.

Повышение трансформационной и фагоцитэрной активности при выписке свидетельствует о нормализации подавленной клеточной иммунологической реактивности больных хронической пневмонией и сопровождается улучшением их общего состояния, аускультативных и рентгенологических данных. Определение клеточного иммунитета согласно предлагаемому способу по трансформационным и фагоцитарным показателям в одном препарате позволяет более точно, статистически достоверно установить различия клеточного иммунитета, в то время как по известному способу выявленные различия статистически недостоверны. Кроме того, значительно сокращается продолжительность исследований, так как определение клеточного иммунитета по фагоцитарной активности согласно извест1686364

А=В- С, где А — расчетный экономический эффект;

 — стоимость прогнозируемого ущерба (4 головы х 12,0 кг х 2,5 руб,);

5 С вЂ” затраты на проведение исследований

А = 4 гол. х 12,0 xr x 2,5 руб. — 10 руб. =

410 руб. или 36,6 тыс. руб, в год в хозяйстве на 800 основных свиноматок.

10 Следует отметить, что определение в данном примере клеточного иммунитета только по бластным клеткам (как это предлагает известное техническое решение) не обеспечивает получения статистически достоверных

15 данных и не определяет клеточный иммунитет с необходимой для прогнозирования заболеваемости и ущерба точностью.

Таким образом, по сравнению с известным, предложенный способ позволяет в бо20 лее короткие сроки (2 ч, а по известному способу только определение фагоцитарной активности требует 4-5 ч и с более высокой точностью определить состояние клеточно о иммунитета. Его использование позволяет

25 избежать ошибок в оценке клеточного иммунитета у больных с инфекционными и другими заболеваниями, при проведении у них лечебных мероприятий. Предлагаемый способ более точно устанавливает клеточный

30 иммунитет у животных, что позволяет повысить экономический эффект и результативность исследований по отбору животных с высокой устойчивостью к заболеваниям.

Способ технологически не сложен, не

35 требует дефицитных или импортных реактивов и оборудования и может быть использован в медицинских и ветеринарных лабораториях в качестве экспресс-метода диагностики и прогнозирования заболеваний человека и

40 животных ному способу требует 4-5 ч, а по предлагаемому способу — 30-40 мин.

Пример 2, Определение клеточного иммунитета, заболеваемости и сохранности поросят различных пород, Определяли клеточный иммунитету 20дневных поросят пород "ландрас" и "крупная белая" в животноводческом хозяйстве промышленного типа. С этой целью животных каждой породы объединяли в группы (no 30 голов в каждой) и проводили определение клеточного иммунитета согласно . предлагаемому способу, а также регистрировали их заболеваемость и сохранность в течение последующих 30 дней наблюдений.

Для определения клеточного иммунитета у всех животных отбирали из ушных вен по 5 мл крови с гепарином и готовили взвеси лейкоцитов содержащие 2,0 х 10 клеток в б

1 мл, Взвести лейкоцитов наносили на отдельные предметные стекла в виде капель и помещали во влажную камеру. Лейкоциты инкубировали при 4"С в течение 2 ч. 3а 30 мин до окончания инкубации к каждой капле клеточной суспензии добавляли равные по объему капли взвеси инактивированных стафилококков, содержавшей 200 млн. микробных тел в 1 мл, По завершении инкубации стекла вынимали из камеры, споласкивали дистиллированной водой, подсушивали, фиксировали 5 мин. в метаноле и окрашивали по Паппенгейму. При микроскопическом исследовании 100 клеток в каждом препарате подсчитывали количество трансформированных лимфоцитов, трансформированных клеток нелимфоидной природы, а также в этих клетках определяли фагоцитарный показатель и фагоцитарное число (см. табл, 2).

Заболеваемость и сохранность поросят определяли путем ежедневных клинических наблюдений.

Из представленных в табл. 2 данных следует, что уровень клеточного иммунитета, определен н ый согласно и редлагаемому способу, статистически достоверно выше у поросят породы "ландрас", Дальнейшие наблюдения за животными показали, что у этих же поросят на 12 ниже заболеваемость и на

3,3 выше сохранность. Это указывает на высокую точность определения у них клеточного иммунитета и возможность прогнозирования по этим показателям ущерба от заболеваемости. Расчетный экономический эффект определения клеточного иммунитета по предлагаемому способу составил

Формула изобретения

Способ определения клеточного иммунитета, включающий выделение лейкоцитов из

45 крови, культивирование их на предметных стеклах и подсчет бластных клеток, отл и ч а юшийся тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени определения, к суспензии лейкоцитов добавляют взвесь

50 инактивированного стафилококка, при этом вносят его в количестве 150-200 млн микробных тел на 1 мл суспензии за 30-40 мин до окончания культивирования и дополнительно определяют фагоцитарную активность

55 лейкоцитов в том же препарате.

1686364

Таблица1

Показатели клеточного иммунитета больных хронической пневмонией р>0,05 р>0,1 р<0,05 р

Таблица2

Показатели клеточного иммунитета, заболеваемости и сохранности поросят различных пород

Пс мф(2,4+:

2)0, Составитель Г. Крекова

Редактор Л. Л|ашкова Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор М, Дечик

Заказ 3594 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101