Способ радиоиммунологического определения аутоантител к тиреоглобулину

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s G 01 N 33/534

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ. ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4625469/14 (22) 26.12.88 (46) 30,09.91. Бюл. М 36 (71) Институт биоорганической химии АН

БССР (72) А.И.Щербань, Т.С,Черкесова, Е.ll.Демидчик и Т,И.Минайло (53) 615.375 (088.8) (56) Acta Endocrlnol, 1982. ч. 101, N 4, р.

555 †5(прототип). (54) СПОСОБ РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ К

ТИPЕОГЛОБУЛИНУ (57) Изобретение относится к области биохимии и медицины, конкретно к радиоиммунологическому определению аутоэнтител (ауто AT) к тиреоглобулину (ТГ) в сыворотке крови человека. Целью изобретения является упрощение способа. Способ включает инИзобретение относится к области биохимии и медицины, конкретно к радиоиммунологическому определению аутоантител (аутоАТ) к тиреоглобулину (ТГ) в сыворотке крови человека. Определение аутоАТ к ТГ используется для диагностики аутоиммунных тиреоидных заболеваний — тиреоидита

Хашимото, диффузного токсического зоба, идиопатической микседемы.

Целью изобретения является упрощение способа за счет использования для построения калибровочной кривой в качестве стандартных растворов аутоАТ к ТГ растворов кроличьих AT к ТГ, конъюгированных с иммуноглобулинами человека.

„„5U „„1681270 Al кубацию исследуемой пробы с раствором меченого йодом — 125 ТГ, внесение в инкубационную среду AT к имуноглобулинам человека, повторную инкубацию, центрифугирование, радиометрию осадка и определение концентрации аутоАТ к ТГ по калибровочной кривой. Особенностью способа является использование в качестве стандартных растворов для построения калибровочной кривой растворов кроличьих

AT к ТГ, конъюгированных с иммуноглобулинами человека. ДиапазЬн определяемых концентраций аутоАТ к ТГ составляет 0,5 — 25 мкг/мл, чувствительность — 0,5 мкг/мл, общее время анализа — 4 ч. Результаты клинической апробации способа свидетельствуют об упрощении его применения в медицинской практике.

Используют калибровочные кривые, получаемые с помощью заявляемого способа при использовании в качестве стандартных растворов кроличьих AT к ТГ, конъюгированных с иммуноглобулинами человека, и растворов аутоАТ к ТГ; совпадение калибровочных кривых свидетельствует о возможности использования растворов кроличьих AT к ТГ, конъюгированных с иммуноглобулинами человека в качестве стандартных. Используют данные по восп,роизводимости результатов измерений концентраций аутоАТ к ТГ в сыворотке крови и результаты определения концентрации аутоАТ к ТГ в сыворотке крови здоровых лиц

1681? 70

35

55 и больных аугоиммунными тиреоидными заболеваниями.

Пример, Для проведения радиоиммунологического определения аутоАТ к ТГ в сыворотке крови человека используются следующие реагенты: I — ТГ с удельной активностью 3 — 6 мкКи/мкг и иммунореактивностью (связывание при избытке AT к

Тг) не менее 857(: препарат — ТГ разбавляют 0,05 М натрийфосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,1 бычий сывороточный альбумин (БСА) и 0,02 Бааз, до такой концентрации, чтобы в 100 мкл содержалось 7 — 10 нг меченого ТГ.

Стандартные растворы ауто к Тà — в качестве стандартных растворов используются растворы кроличьих антител к ТГ, конъюгирован ных с иммуноглобулинами человека, в сыворотке крови человека, эквивалентные следующим концентрациям аутоАТ к ТГ: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 10; 25 мкг/мл.

Иммуносорбент — 10 раствор козьих

AT к иммуноглобулинам человека, иммобилизованных на бактериальной стенке золотистого стафиллококка.

Буферный раствор — 0,05 M натрийфосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0 1

БСА и 0,02 йайз.

Проведение анализа.

1. Пробирки для анализа (в дубликатах) маркируют следующим образом; Т вЂ” общая активность I — ТГ, Вн — неспецифически

125 связанный I — ТГ, С1 — С5 — стандартные

125 растворы аутоАТ к ГГ соответственно 0,5—

25 мкг/мл, Сх — исследуемые пробы сыворотки крови, 2. В пробирки Вн вносят по 10 мкл стандартного раствора "0 мкг/мл", В пробирки

С1 — C5 вносят по 10 мкл соответствующих стандартных растворов. В пробирки Сх— вносят по 10 мкл исследуемых сывороток крови.

Исследуемую сыворотку крови с концентрацией аутоАТ к TF более 25 мкгlмл необходимо развести "нулевым" стандартным раствором (О мкг/мл), 3. Во все пробирки, кроме Т, вносят по

100 мкл буферного раствора.

4. Во все пробирки вносят по 100 мкл

I — ТГ.

5. Пробирки закрывают пробками, содержимое каждой пробирки перемешивают на вихревом смесителе и инкубируют пробирки в течение 2 ч при 37 С.

6, Во все пробирки, кроме Т, вносят по

250 мкл иммуносорбента. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают на вихревом смесителе и инкубируют пробирки в течение 1,5 ч при комнатной температуре.

7, Все пробирки, кроме Т, центрифу ируют при 1500 -2000 g в течение 15 минут

8, Удаляют надосадочную жидкость с помощью водоструйного насоса, избегая захватывания осадка, 9. Во все пробирки, кроме Т, вносят по

1 мл буферного раствора, содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают на вихревом смесителе и центрифугируют пробирки согласно и, 7, 10. Удаляют надосадочную жидкость согласно и. 8.

11. Все пробирки помещают в гамма125 счетчик и измеряют скорость счета I в каждой пробирке в течение 1 мин.

Расчеты и графические построения.

Находят средние арифметические значения скоростей счета для каждой пары пробирок, Из полученных значений скоростей счета, кроме значения скорости счета для . пробирок Т, вычитают среднее арифметическое значение скорости счета в пробирках

Вн (неспецифически связанный — ТГ). На

l - 12 основании полученных значений скоростей счета (В) рассчитывают величину В. 100/Т для каждого стандартного раствора и исследуемой пробы.

Строят калибровочную кривую в полулогарифмических координатах, откладывая на оси ординат (линейная) значения В"

<00/Т, а по оси абсцисс (логарифмическая) — значения концентраций аутоАТ к ТГ в мкг/мл в соответствующих стандартных растворах. Для исследуемых проб на основании соответствующих значений В 100/Т определяют по калибровочному графику концентрацию аутоАТ к ТГ

Упрощение известного способа дости гается использованием для построения ка либровочной кривой в качестве стандартных растворов кроличьих AT.ê ТГ, коньюгированных с иммуноглобулинами че ловека. т.е. доступных в больших количест вах компонентов. Доступность стандартных растворов делает возможным широкое при менение заявляемого способа.

Заявляемый способ также как и известный способ характеризуется высокой точностью, о чем свидетельствуют низкие значения коэффициента вариации результа тов определения концентрации аутоАТ к ТГ

Результаты определения аутоАТ к ТГ в сы воротках крови здоровых лиц и больны. аутоиммуными тиреоидными заболевания ми с помощью заявляемого способа соо1 ветствуют данным литературы ь свидетельствуют о возможности примене ния способа в медицинской практике.

16812 10

Формула изобретения

Составитель Бонарцев

Редуктор Л.Веселовская Техред М.Моргентал Корректор Н.Король

Заказ 3311 Тираж 388 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Способ радиоиммунологического определения аутоантител к тМреоглобулину путем инкубации сыворотки крови с 5 раствором меченого йодом — 125 тиреоглобулина, внесения в инкубационную смесь антител к иммуноглобулинам человека, повторной инкубации, центрифугирования, отделения осадка и его радиометрии с по- 10 следующим определением концентрации аутоантител к тиреоглобулину по калибро вочной кривой, построенной при использовании стандартных растворов антител к тиреоглобулину, отличающийся тем. что, с целью упрощения способа, в качестве стандартных растворов антител используют растворы кроличьих антител к тиреоглобулину, конъюгированных с иммуноглобулинами человека.