Способ определения активности орнитиндекарбоксилазы в тканях животных

 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения активности орнитиндекарбоксилазы в тканях животных. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ заключается в том, что препарат ткани инкубируют с орнитином и пиридоксальфосфатом, осаждают белки, к супернатанту добавляют дансилхлорид и проводят с ним инкубацию не менее 18 ч. Затем окрашенный продукт экстрагируют бензолом, взятым при объемном соотношении к раствору окрашенного комплекса 1:(1,3-1,5). Полученный осадок дансилпутресцина растворяют в ацетоне, проводят восходящую хроматографию в тонком слое силикагеля в системе растворителей бензол:триэтаноламин (5.0-5,5): 1 и выявляют индивидуальную фракцию дансилпутресцина , количество которого определяют флюориметрически. Способ позволяет повысить точность определения орнитиндекарбоксилазы в 2-6 раз. со С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 N 33/573

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

N«f-ÌéÌ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4413722/14 (22) 19.04.88 (46) 23.10.91. Бюл. ¹ 39 (71) Университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы (72) С,П. Сяткин и T.Т. Березов (53) 612.015 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 859440, кл. G 01 N 33/48,1981. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ОРНИТИНДЕКАРБОКСИЛАЗЫ B ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения активности орнитиндекарбоксилазы в тканях животных. Цель изобретения — повышение точности способа. Способ заключается

Изобретение относится к биохимии, а именно к знзимологии, и может быть использовано для определения активности орнитиндекарбоксилазы (ОДК) в тканях животных.

Цель изобретения — повышение точности способа, Способ осуществляют следующим образом;

В качестве источника фермента используют супернатант 33 ф,-ного гомогената, полученный центрифугированием при

20 000 g в течение 20 мин. Инкубацию пробы, содержащей в 0,4 мл конечного объема 4 ммоль орнитина, 20 мкмоль пиридоксальфосфата, 5 мкмоль дитиотреитола, 5 ммоль К-Na-фосфатного буфера и 9,5+0,7 мг

„„5U„„1686373 А1 в том, что препарат ткани инкубируют с орнитином и пиридоксальфосфатом, осаждают белки, к супернатанту добавляют дансилхлорид и проводят с ним инкубацию не менее 18 ч, Затем окрашенный продукт экстрагируют бензолом, взятым при объемном соотношении к раствору окрашенного комплекса 1:(1,3 — 1,5). Полученный осадок дансилпутресцина растворяют в ацетоне, проводят восходящую хроматографию в тонком слое силикагеля в системе растворителей бензол:триэтаноламин (5,0 — 5,5);1 и выявляют индивидуальную фракцию дансилпутресцина, количество которого опре.деляют флюориметрически, Способ позволяет повысить точность определения орнитиндекарбоксилазы в 2 — 6 раз, белка (источник фермента), при 37 С прекращают через 1 ч добавлением 0,1 мл 0,2 М

НС! 04 Осадок отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин. Дансилирование проводят, добавляя к 0,1 мл супернатанта 0,3 мл раствора дансилхлорида в ацетоне (4 мг/мл) и 6 мг Иа2СОэ10НрО.

Пробы инкубируют не менее 18 ч в темноте при комнатной температуре. Продукты реакции зкстрагируют бензолом в объемном соотношении 1:(1,3 — 1,5), Органический слой выпаривают, сухой осадок растворяют в 20 мкл ацетона и наносят на пластины Силуфол

IJV-254. Одномерно восходящую хроматографию проводят двукратно в системе бензол-триэтиламин в соотношении (5,0-5,5):1.

Интенсивность флуоресценции дансилпут1686373

Таблица1,Число животных ент затели гвен.чен

23 пер и нс

27

8 (Р22 < 0,001

Р1-ь < 0.05

12

8 ресцина измеряют на микроскопе ПРОТВАС при 488 нм. Длина волны возбуждения 365 нм.

За единицу активности ОДК принимают

1 катал, Удельную активность фермента вы- 5 ражают в и каталах, отнесенных к 1 мг белка.

Пример, Работу выполняют на самцах беспородных крыс и мышей линии СЗПА гепатомы 48 и Г-27, Исследую также малиг- 10 ниэирущую, регенерирующую и нормальную печень. Ткань гомогенизируют в 0,5 мМ фосфатном буфере (pH 7,2), содержащем 0,1 мМ дитиотреитог и 0,4 мл пиридоксальфосфат. Дальнейшее определение активности 15

ОДК проводят по предлагаемому спссобу.

Численные данные опытов подвергают статистической обработке. Различия между средними величинами (Х) расценивают как статистически достоверные при значении 20 р 0,05.

Апробацию данного метода осуществляют в исследованиях уровня активности

ОДК в печени интактных животных и тканях с усиленной клеточной пролиферацией. Об- 25 наружено статистически достоверное увеличение активности ОДК в регенериру:ощей и малигнизирующей печени, а также в ткани гепатом Г-27 и 48.

Активность ОДК (и каталов на 1 мг белка) в гепатомах Г-27 и 48 и в ткани нормальной и регенерируюшей печени интактных и получавших НДЭА животных приведена в табл. l. 35

Данные, приведенные в табл.2 и 3, показывают преимущества предлагаемого способа перед известным.

Активность ОДК (n каталов на 1 мг бел- 40 ка) из печени интактных животных перевивных гепатом приведена в табл, 2.

Из табл.2 видно, что активность ОДК в одном и том же обьекте в ?-8 раз выше, когда определение проводят по предлагае- 45 мому способу. Кроме того, точность анализа также выше в 2 — 4 раза.

В табл,3 приведены данные сравнительной оценки достоверности результатов анализа активности ОДК известным и предлагаемым способами.

Из табл.3 видно, что величина удельной активности ОДК из нормальной печени крыс, определенная предлагаемым способом, в 2 раза выше, чем определенная по известному способу, Надежность, точность и воспроизводимость результатов также выше в 2-6 раза, Представленные численные данные доказывают положительный эффект способа, заключающийся в повышении его чувствительности определения в 23 раза, а также в повышении точности, воспроизводимости и надежности способа в 2-6 раз по сравнению с известным.

Формула изобретения

Способ определения активности орнитиндекарбоксилазы в тканях животных, включающий гомогенизацию ткани, центрифугирование, получение супернатанта, инкубацию с субстратом, осаждение белка, защелачивание среды, добавление реагента, образование окрашенного комплекса с путресцином, экстрагирование комплекса органическими растворителями с последующей регистрацией окрашенного комплекса, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве реагента используют дансилхлорид, инкубацию с которым проводят не менее 18 ч, экстрагирование производят бензолом, взятым в обьемном соотношении к раствору окрашенного комплекса 1;(1,3-1,5), полученный осадок дансилпутресцина растворяют в ацетоне, проводят восходящую хроматографию в тонком слое силикагеля в системе растворителей бензол — триэтаноламин (5,0 — 5,5):1 и выявляют индивидуальную фракцию дансилпутресцина, количество которого определяют флуориметрически.

1686373

Продолжение табл.1

Примечание; х - выборочное среднее

Sx — стандартное отклонение среднего результата, Р - уровень доверительной вероятности, Таблица2

Табл ицаЗ

Способ оп е еления

Основные метрологические характеристики

Предлагаемый

Известный

Выборочное среднее (х) Стандартное отклонение среднего результата () Абсолютная вопроизводимость:

Среднее отклонение от среднего

Стандартное отклонение

Относительная воспроизводимость, ь

Относительное среднее отклонение (Ех ) Относительное стандартное отклонение

0,18

0,09

+0,003

+. 0,01

0,007

0,002

0,02

0,03

3,89

22,22

33,33

Примечание; Расчеты статистических показателей проводят на основе результатов десяти паралельных определений активности ОДК в препаратах из нормальной печени крысы.