Способ получения ноурзеотрицина

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частносы к производству антибиотиков Штамм Streptomyces noursei 33700, ZIMbT 43701 или ZIMET 43708 культивируют в ферментационной среде, которая в качестве источника углевода содержит кукурузный крахмал, картофельный крахмал и пшеничную муку, в глубинных аэробных условиях при 28 - 32°С. В процессе ферментации поддерживают величину рН на уровне 5,0 - 7,0. Продолжительность процесса 68 - 144 ч. Введение углевода разовое или дробное Выход ноурзеотрицина от 6 до 15 г/л культуральной жидкости. 3 з.л. ф-лы, 5 табл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (! 9) (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (89)DD/231949 (48) 15.01.86 (21) 7773571/13 (22) 01,10.84 (31) \ИРС 12 Р/255 945 (32) 25.10.83. (33) DD (46) 30.11.91. Бюл. ¹ 44 (71) Народное предприятие "Йенафарм "(00) (72) Михаэль Меннер, Эрнст Йоахим Борманн, Матиас Гиллигер, Петер-Юрген Мюллер, Мартин Рот, Гарольд Бокер, Ганс-Лельмут Гроссе, Фридрих Бергтер, Вернер Гесс, Юлиане Кедель, Ингеборг

Геллер и Гунтер Планка (DD) (53) 615.779.93 (088.8) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу ферментативного получения антибиотика нуорзеотрицина, имеющего .эрготропное действие, а в то же время и важное экономическое значение для сельского хозяйства и фармацевтической промышленности.

Известен способ получения ноурзеотрицина, предусматривающий культивирование штамма Streptomyces noursei iA

3890 b в глубинных аэробных условиях (патент ГДР N- WP А 61 К/223321, кл. Н 04 R

17/00, 1983).

Однако в данном способе используют ингибиторы дыхательной цепи типа щелочных азидов, бренцкатехинов и/или амита(s1)s C 12 P 1/06// (С 12 Р 1/06, С 12 R 1:57) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОУРЭЕОТРИЦИНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частност;1 к производству антибиотиков, Штамм

Streptemyces noursei 2!MET 33700, 2!МЕТ

43701 или 2iMET 43708 культивируют в ферментационной среде, которая в качестве источника углевода содержиг кукурузный крахмал, картофельный крахмал и пшеничную муку, в глубинных аэробных условиях при 28 — 32 С. В процессе ферментации поддерживают величину рН на уровне 5,0—

7,0. Продолжительность процесса 68 — 144 ч. Введение углевода разовое или дробное.

Выход ноурзеотрицина от 6 до 15 r/л культуральной жидкости. 3 з.п, ф-лы, 5 табл, ля, а также веществ, ингибирующих перенос аминокислот.

В публикации(6гаГе U., Bocker Н, Reinhard

G. und Thrum Н. Regulative Beeinflussung des

Nourseothricinbiosynthese durch o-Amino

benzoesaure in Kuituren des Streptomyces

noursel lA 3890Ь, -2, Allg. fv1ikrobioi 1974, 14, 659 — 673) описывается питательная среда, в которой кукурузный крахмал используется в качестве источника углерода. B этом процессе с использованием исходного штамма Streptomyces noursei IA 3890 b тоже с прибавлением ингибиторов названных типов и ингибиторов, описываемых в описании к патенту WP А 61 К/223321, достигается настолько незначительный выход ноурзеотрицина, что экономическое производство оказывается невозможным. (О фа (: фь. ь

1694642

Цель изобретения — получение ноурзеатрицина достаточно эффективным способом на малогексозных, в частности малоглюкозных, питательных средах. В основу изобретения положена задача представить удобный в техническом отношении способ, который позволяет осуществить промышленное производство ноурзеотрицина посредством малогексоэного, димер-, олигомер- или полимерсодержащего источника углерода в.питательной среде..

Найдено, что определенные ноурэеотрицинопродуцирующие штаммы, отличающиеся достаточной амилолитической активностью, с использованием крахмала в качестве первичного малогексозного полимерного источника углеводов накапливают в питательной среде большие количества ноурзеотрицина. Эти штаммы накапливают ноурзеотрицин в таких больших количествах также беэ прибавления ингибиторов дыхательной цепи и, соответственно, переноса аминокислот. Такие результаты получены, например, на ноурэеотрицинопродуцирующих штаммах, депонированных в коллекции Института под номером ZIMET 43700, ZIMET 43701 и ZIMET 43708.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Вегетативный посевной материал используемого ноурзеотрицинообразующего штамма, который получен путем выращивания в нескольких стадиях из консервированного мицелия, служит для засева ферментационных питательных сред.

Среды имеют следующий основной состав . крахмал, в частности кукурузный, в качестве основного источника углеводов в количестве 50 — 150 r на 1 л; комплексные источники азота в виде арахисного шрота или соевого шрота в количестве 5 — 25 г на 1 л и/или,кукурузный экстракт в количестве 1 — 10 г на 1 л; неорганический источник азота, например сульфат аммония в количестве 5 — 15 г на 1л; карбонат кальция, например в виде мела, в количестве 4 — 20 r на 1 л; пеногаситель, например пеногаситель на силиконовой или полиэтиленовой основе или/и растительные жиры.

В течение 72 — 196-часовой ферментации при температурах 28 — 30 С с дополнительным прибавлением и без него ожиженных концентрированных полимерных источников углеводов с использованием ферментных препаратов с амилолитической активностью, например пивоваренного фермента, а также при под20

55 держании кислотности культуральной жидкости прибавлением 25 -ного раствора гидроокиси аммония на уровне рН 5,0 — 8,0, предпочтительно при рН 5,5 — 6,5, достигается высокая концентрация ноурзеотрицина в культуральной жидкости.

Выделение и очистку ноурэеотрицина проводят известным путем, Пример 1. Из консервированного мицелия штамма Streptomyces noursel

ZIMET 43700 выращивают предварительные культуры в широкогорлых колбах емкостью 500 мл и 100 мл и, соответственно, в колбах Эрленмейера емкостью 2,5 л по 400 мл питательной среды, имеющей следующий состав: в 1 л водопроводной воды содержится 15 г арахисового шрота, 10 г кукурузного экстракта 100 сухого вещества, 40 г мальтозы, 5 r сульфата аммония, 6 r карбоната каЛьция. Устанавливают перед стерилизацией рН 6,5 — 6,8. Стерилизацию проводят в течение 35 мин при 121 С.

Культуру первого пассажа культивируют в течение 48 ч при 29 — 30 С на круговой, качалке. После получения достаточного количества мицелия по 20 мл суспензии предварительной культуры используют в качестве посевного материала для второго пассажа и выращивают в течение 24 ч в тех же условиях.

Для засева 10 л питательной жидкости в 15-литровом ферментаторе используют содержимое двух колб второго пассажа культивирования. Состав питательной среды следующий; на 1 л водопроводной воды берут 80 г кукурузного крахмала, 25 r арахисового шрота, 10 г кукурузного экстракта, 10 r сульфата аммония, 3 r подсолнечного масла, 5 г мела острова Рюген. Устанавливают перед стерилизацией рН 6,8 — 7,0.

Стерилизацию проводят в течение 30 мин при 121ОС. Во время ферментации дважды прибавляют по 300 r крахмала (после обработки известным образом пивоваренным ферментом). Кислотность ферментационного раствора поддерживают постоянной на уровне рН 6,2 при помощи гидроокиси аммония. По окончании 144-часовой ферментации с числом оборотов 360 o6/мин и скоростью аэрации 0,75 об/об/мин получают 7,2 г ноурзеотрицина на 1 л культуральной жидкости.

Пример 2. В две колбы на качалке (2 5 л), содержащие каждая по 400 мл питательной среды, засевают по 0,5 мл суспензии консервированного мицелия штамма

S.noursei ZIMET 43701 и культивируют в течение 48 ч при 29 С на круговой качалке.

Питательная среда имеет следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 15 г

1694642 кукурузного крахмала, 15 г соевого шрота, 0,3 г дигидрофосфата калия, 5 г хлорида натрия, 1 r карбоната кальция. Устанавливают перед стерилизацией рН 6,5 - 6,8. Стерилизацию проводят в течение 30 мин при

121 С.

Соединенное содержимое первых предварительных культур используют для засева 250-литрового посевного ферментатора, содержащего 150 л питательной среды такого же состава, как у первой предварительной культуры. Культивирование осуществляют в течение 40 ч при 29 С с числом оборотов 240 об/мин и скоростью аэрации

0,5 об/об/мин, 45 л полученной посевной культуры (6,8 — 7,0) используют в качестве инокулюма для засева 400 л питательной среды в 720-литровбм ферментаторе. Культивирование производят при скорости аэрации 1,0 об/об/мин и числе оборотов

320об/мин при 29 С. Кислотность культуры автоматически поддерживают постоянной на уровне 6,2 прибавлением 25 -ного раствора гидроокиси аммония.

Питательная среда имеет следующий состав:на 1 л водопроводной воды приходится 60 г кукурузного крахмала, 10 г арахисового шрота, 2 г кукурузного экстракта, 8 rсульфата аммония,,0,,05 г сульфата цинка, 0,03 г сульфата марганца, 0,5 г подсол.нечного масла, 3,75 г мела острова Рюген, Кислотность питательной среды устанавливают перед стерилизацией 6,8 — 7,0. Стерилизацию производят острым паром при

120 С в течение 30 мин. В процессе ферментации, т.е. на 30, 45, 70, 100, 120 ч, прибавляют к среде по 6 кг кукурузного крахмала, ожиженного пивоваренным ферментом до концентрированного раствора (около 307ного). После 120-часовой ферментации получают 550 л культуральной жидкости, которая содержит ноурзеотрицин в концентрации 6,53 г на 1 л.

Пример 3. Для выращивания посевного материала лиофилизированный на глюкозожелатине высушенный консервированный мицелий (вес брутто около 300 кг) штамма S. noursel ZIMET суспендируют в 3

° мл физиологического раствора пивоваренной соли, 0,5 мл питательной среды первого пассажа. Питательная среда имеет следующий состав: иа 1 л водопроводной воды берут 40 г глюкозы, 15 г соевого шрота, 0,3 r гидрофосфата калия, 5 г хлорида натрия, 3 г карбоната кальция . Перед стерилизацией устанавливают рН среды 6,5. По 400 мл этой среды заливают в закрываемые ватной пробкой широкогорлые колбы емкостью 2,5 л. Стерилизацию проводят в автоклаве при

120ОС в течение 35 мин. Засеянные культу5

55 ры инкубируют на круговых качалках при

29 С в течение 48 ч, 800 мл получаемой культуральной жидкости первого пассажа используют для второго пассажа — для засева 180 л среды, стерилизованной паром (45 мин при 120 С), такого же состава, как в первом пассаже, содержащейся в ферментаторе иэ высококачественной стали (o6щий объем 250 л). Культивирование осуществляют в течение 40 ч (рН 5.1 — 5,3) при 28 — 29 С, числе оборотов 240 об/мин и скорости аэрации 1,0 об/o6/мин. Для основной культуры используют ферментатор из высококачественной стали (общий объем

4200 л), наполненный 2500 л питательной среды, имеющей следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 62,5 г кукурузного крахмала, 2,5 г глюкозы, 12r соевого шрота, 11 г сульфата аммония, 2 г сульфата. магния, 1 r хлорида натрия, 6 r карбоната кальция, 0,5 г сульфата цинка, 0,5 г полипропиленгликоля.

Кислотность среды устанавливают перед стерилизацией 6,2, Стерилизацию питательной среды (без глюкозного компонента) проводят in situ путем предварительного нагрева паром рубашки до 75 С и последующего нагрева острым паром до

120 С в течение 15 мин. После охлаждения до 29 С прибавляют в асептических условиях глюкозу, раздельно простерилизованную в виде 40 -ного водного раствора нагревом до 120 С в течение 30 мин. Перед засевом устанавливают серной кислотой исходную кислотность питательной среды

6,8 «+ 0,1.

Засеянную 4 Д инокулюма второго пассажа ферментационную среду основной культуры культивируют в течение 140 ч при

29 С, скорости аэрации 0,5 об/об/мин (О—

20-й часы) или 1,0 об/об/мин (20 — 140-й часы) и при избыточном давлении 0,03 МПа при перемешивании с числом оборотов 180 об/мин. Кислотность культуральной жидкости поддерживают постоянной 25ь-ным раствором гидроокиси аммония на уровне

6,0+0,1 после физиологически обусловленного медленного снижения исходного значения рН.

В результате биологического теста в культуральной жидкости определены следующие количества продукта (см.табл.1).

Пример 4. Предварительное культивирование производят по примеру 3 с использованием штамма ZIMET 43708. Для оснОвной культуры используют ферментатор из высококачественной стали (общий объем 720 л), который наполнен 500 л питательной среды, имеющей следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 62,5

1694642 г кукурузного крахмала, 2,5 г глюкозы, 12 r соевого шрота, 11г сульфата аммония, 2 г сульфата магния, 1 r хлорида натрия, 6 r карбоната кальция, О 1 r сульфата железа (III), 0,5 г полипропиленгликоля. Кислотность раствора устанавливают перед стерилизацией 6,2. Стерилизацию питательной среды (беэ глюкозного компонента) проводят In situ предварительным нагревом паром рубашки до 75 С и последующим нагревом острым паром до 120 С в течение

15 мин. После охлаждения до 29 С прибавляют в асептических условиях глюкозу, раздельно простерилизованную в форме

50 -ного водного раствора нагревом до

120 С в течение 30 мин. Перед засевом при йомощи серной кислоты производят установку начальной кислотности питательной среды 6,8+0.1. Засеянную 4;5 инокулюма второго пассажа ферментационную среду основной культуры культивируют в течение

116 ч при 29 С, скорости аэрации 0,5 об/об/мин (О-20-й часы) или 1,0 об/об/мин (20 — 116-й часы) при избыточном давлении

0,03 МПа и перемешивании с числом оборотов 320 об/мин. Кислотность культуральной жидкости поддерживают постоянной

257;-ным раствором гидроокиси аммония на уровне 6.0+ 0,2 после физиологически обусловленного медленного снижения начального значения рН.

В результате биологического теста в культуральной жидкости определены следующие концентрации продукта (см.табл.2.).

Пример 5, Предварительное культивирование проводят по примеру 3 и используют штамм 43708.

Для основной культуры используют ферментатор из высококачественной стали (общий объем 450 л), который наполнен 300 л питательной среды, имеющей следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут

120 г кукурузного крахмала; 5 r глюкозы, 24 г соевого шрота, 11 г сульфата аммония, 2 r сульфата магния, 1 r хлорида натрия, 6 r карбоната кальция, 0,5 r сульфата цинка, и

0,5 r полипропиленгликоля.

Для ожижения большой доли полимерного источника углеводов используют известным образом пивоваренный фермент, После энзиматического гидролиза крахмала вливают остаточные компоненты питательной среды. Стерилизацию питательной среды .осуществляют нагревом до 120 С в течение 15 мин. После охлаждения до рабочей температуры перед засевом при помощи серной кислоты устанавЛивают кислотность питательной среды 6,8+0,1. Засеянную 4 инокулюма второго пассажа культивирования ферментационную культуру культивируют в течение 124 ч при 29 С, скорости аэрации 0,5 об/об!мин (О-20-й часы) или 1,0 об/об/мин (20 — 124-й часы) при

5 избыточномдавлении 0,03 МПа при переме- . шивании с числом оборотов 400 об/мин.

К 16-му часу ферментации прибавляют

2 мг л источник фосфора (например, дигидрофосфат калия) в форме стерилиэован10 ного водного раствора. Кислотность культуральной жидкости (рН) поддерживают постоянной на уровне.6,0+ 0,2 при помощи 25 -ного раствора гид роокиси аммония после физиологически обуслов15 ленного медленного снижения начального значения рН.

В результате биологического теста в культуральной жидкости определяют следующие концентрации продукта (см.табл.3).

20 Пример 6. Предварительное культивирование проводят по примеру 3, используют штамм 43708.

Питательная среда и ее приготовление идентичны представленным в примере 3. Ис25 пользуют два ферментатора из высококачественной стали (общий объем 720 л), каждый из которых наполнен 500 л питательной среды.

Количество инокулюма и режим процесса соответствуют условиям, представ30 ленным в примере 3. В ферментационную среду на 12-м часу ферментации добавляют

10 мг л " источника фосфора (как дигидрофосфат калия) в форме стерилизованного водного раствора. Другая ферментацион35 ная среда добавок не содержит.

В результате биологического теста в культуральных жидкостях определены концентрации ноурзеотрицина, увеличивающиеся с различной скоростью (см.табл.4).

40 Пример 7. Предварительное культивирование проводят по примеру 3, используют штамм 2ИМЕТ 43708.

Для основной культуры используют ферментатор из высококачественной стали

45 (общий объем 720 л), который наполнен 500 л питательной среды, имеющей следующий состав: из расчета на 1 л водопроводной воды берут 62,5 г кукурузного крахмала. 2,5 г глюкозы, 16 г соевого шрота, 11 г сульфата

50 аммония, 2 г сульфата магния, 1 r хлорида натрия, 6 r карбоната кальция, 0,13 r сульфата-гидрата алюминия, 0,5 г полипропиленгликоля. -Кислотность раствора устанавливают перед стерилизацией 6,2.

55 Стерилизацию осуществляют нагревом до

120 С в течение 15 мин. После охлаждения до 29 С перед засевом устанавливают начальную кислотность питательной среды (рН) серной кислотой 6,8+ 0,1. Основную ферментационную среду, засеянную 4

1694642

Таблица 1

Таблица 2 инокулюма второго пассажа культивирования, культивируют в течение 116 ч при температуре до 29 С, скорости аэрации 0,5 об/об/мин (Π— 20-й часы) или 1,0 об/об/мин (20-116-й часы) при избыточном давлении 0.,03 МПа и перемешивании с числом оборотов 320 об/мин. Кислотность культуральной жидкости поддерживают постоянной 25fg-ным раствором гидроокиси аммония на уровне 6,&f0,3 после физиологически обусловленного медленного снижения начального значения рН.

В результате биологического теста в культуральной жидкости определены следующие концентрации продукта (см.табл.5).

Пример 8. Выращивание продукта

S.nourseI ZIMET 43716 осуществляют по примеру 1. Для засева 15-литрового ферментатора, заполненного 10 л питательной среды, используют содержимое двух колб

2-й фазы культивирования. Питательная среда содержит в 1 л водопроводной воды

60 г картофельного крахмала, 5 r глюкозы, 10 r экстракта соевого шрота. 11 г сульфата аммония,-2 г сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 6 г карбоната кальция, 0,5 r сульфата цинка. Стерилизацию осуществляют в течение 30 мин при 121ОС, рН поддерживают постоянной на .уровне 6,2 гидроокисью аммония. Через 144 ч ферментации при числе оборотов 360 об/мин, скорости аэрации 0,75 об/об/мин и температуре 28 — 30 С образуется 2,1 r ноурзеотрицина на 1 л культуральной жидкасти.

Пример 9. Осуществляют способ в соответствии с примером 8 с использованием штамма 43708. Из питательной среды исключают сульфат цинка. Через 144 ч фер.ментации образуется 6,5 г/л антибиотика.

Пример 10, Осуществляют способ в

5 соответствии с примером 8 с использованием штамма 43708. В ы ра щи в а н ие и ров од ят в питательной среде, содержащей в 1 л водопроводной воды 80 r пшеничной муки, 5 r глюкозы, 10 г экстракта соевого шрота, 11 г

10 сульфата аммония, 2 г сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 6 г карбоната кальция.

Через 144 ч ферментации образуется 6,9 r/ë антибиотика.

Формула изобретения

15 1. Способ получения ноурэеотрицина путем выращивания продуцента вида

Streptomyces noursel a глубинных аэробных условиях в питательной среде, содержащей источник азота, углевод и минеральные

20 соли, при температуре 28 — 32 С и поддержании кислотности культуральной жидкости в пределах рН 5,0 — 7,0, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что в качестве продуцента используют штамм Streptomyces noursei ZIMET

25 33700, ZIMET 43701 или ZlMET 43708. в качестве углевода в питательной среде используют кукурузный крахмал, картофельный крахмал или пшеничную муку и культивирование ведут в течение 68 — 144

30 ч..

2..Способ по пЛ, отличающийся тем, что осуществляют разовое выделение углевода.

3. Способ по пп.1 и2, отл и ч а ющий35 с я тем, что осуществляют дополнительную дробную подачу углевода.

4. Способ попп.1 — 3, отл ич а ющи йс я тем, что кукурузный крахмал вводят после предварительной ферментативной об40 работки.

1694642

12

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Составитель Г.Смирнова

Редактор M.Ïåòðîâà Техред М.Моргентал Корректор О Кравцова

Заказ 4130 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101